TRPP2 channels regulate apoptosis through the Ca2+ concentration in the endoplasmic reticulum

doi:10.1038/emboj.2008.307

.2009年3月4日；28(5):490-9.

doi:10.1038/emboj.2008.307。 Epub 2009年1月15日。

TRPP2通道通过内质网中Ca2+浓度调节细胞凋亡

托马斯·韦吉尔斯基¹, 丹尼尔·斯特夫, 克里斯托夫·科普, 罗伯特·陶伯, 比约恩·巴赫霍尔茨, 罗兰·尼奇克, E沃尔夫冈·奎恩, 格德·沃尔兹, 迈克尔·科特根

附属公司

PMID： 19153608
预防性维修识别码：第657577页
内政部： 10.1038/emboj.2008.307

TRPP2通道通过内质网中Ca2+浓度调节细胞凋亡

托马什·韦吉尔斯基等。欧洲工商管理硕士J. 2009.

.2009年3月4日；28(5):490-9.

doi:10.1038/emboj.2008.307。 Epub 2009年1月15日。

作者

附属

¹德国弗莱堡大学医院肾脏科。

PMID： 19153608
预防性维修识别码：项目经理2657577
内政部： 10.1038/emboj.2008.307

摘要

Ca（2+）是一种重要的信号分子，调节多种细胞过程，包括凋亡。虽然已知通过质膜中的瞬时受体电位（TRP）通道流入Ca（2+）可触发细胞死亡，但细胞内TRP蛋白在调节Ca（2+）依赖性信号通路和细胞凋亡中的功能仍不明确。在这里，我们表明，常染色体显性多囊肾病（ADPKD）中突变的离子通道TRPP2通过降低内质网（ER）中的Ca（2+）浓度来保护细胞免受凋亡。ER-resident TRPP2通过增加ER-Ca（2+）通透性来抵消肌内质Ca（2+）ATP酶的活性。这导致在刺激肌醇1,4,5-三磷酸受体时，细胞溶质和线粒体Ca（2+）信号减弱，并减少内质网对凋亡刺激的Ca（2+）释放。相反，肾上皮细胞中TRPP2的敲低增加了ER-Ca（2+）的释放，并增加了对凋亡的敏感性。我们的研究结果表明，ER-resident TRPP2在调节细胞内Ca（2+）信号方面具有重要作用，并为TRPP2通道功能丧失后ADPKD细胞凋亡率增加提供了分子机制。

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数字

图1
TRPP2通道功能爪蟾卵母细胞。(A类)表达TRPP2的卵母细胞（虚线）或注水对照细胞（实线）的电流-电压（I–V）关系。(B类)将（A）中的数据分组。根据欧姆定律计算整个电池的电导（G）。(C类)对照卵母细胞在对照溶液中（虚线）或用胰蛋白酶刺激后（10μg/ml；实线）的电流-电压关系。(D类)在对照溶液（虚线）或用胰蛋白酶刺激后表达TRPP2的卵母细胞的电流-电压关系（实线）。(E类)胰蛋白酶诱导的对照细胞和表达TRPP2的细胞的全细胞电流的时间进程。在电压钳条件下记录电流。电压钳(*V（V）*_c（c）)协议如图所示。(F类)来自（E）的分组数据。在峰值电流下计算胰蛋白酶诱导的全细胞电导（黑色条）（灰色条：对照溶液中的电导）。^*和^§指出所示的统计显著差异。

图2
TRPP2定位于ER并调节Ca²⁺发出信号。(A类)转染TRPP2和ER标记物BAP31.GFP的HEK 293细胞（中面板）用抗TRPP2抗体染色（左面板，比例尺：10μm；蓝色：用Hoechst 33342进行核染色）。(B类)呋喃-2钙²⁺测量：瞬时TRPP2或Bcl-2表达对钙的影响²⁺从HEK 293细胞的细胞内储存释放。在缺乏细胞外钙的情况下，用10μM ATP刺激嘌呤能受体²⁺. (C类)峰值Ca时（B）的组数据²⁺增加（ATP诱导的峰值-基线）。(D类)western blotting分析转染TRPP2编码质粒或空载体的HEK 293细胞裂解液中SERCA2和Bcl-2的水平。

图3
TRPP2降低GPCR依赖性钙释放²⁺来自ER(A类)用抗TRPP2抗体免疫印迹法检测TRPP2在HeLa稳定细胞系中的表达（对照：用空载体pLXSN产生的逆转录病毒转导的HeLa细胞；*TRPP2型*：用编码TRPP2的逆转录病毒转导的HeLa细胞）。分析14-3-3蛋白水平作为负荷控制。(B类)呋喃-2钙²⁺测量：HeLa细胞中TRPP2稳定表达对钙释放的影响²⁺使用thapsigargin（TG，10μM）从ER中提取。(C类)TRPP2在HEK 293细胞中瞬时表达对钙释放的影响²⁺使用离子霉素（Iono，5μM）从ER中提取。（B）和（C）中的实验是在没有细胞外Ca的情况下进行的²⁺. (D类)峰值Ca时（B）的组数据²⁺增加（TG诱导的峰值−基线）(n个=11). (E类)峰值Ca时（C）的分组数据²⁺增加(n个=9).

图4
TRPP2降低[Ca²⁺]_急诊室和线粒体钙²⁺信号。(A类)针对ER的Cameleon（YC4_急诊室)与TRPP2（用抗TRPP2抗体免疫修饰）在HeLa细胞中共定位（比例尺：10μm）。(B类)YC4归一化荧光发射比（535/480nm）的校准_急诊室与空载体（对照）或TRPP2（10μM离子霉素，0.5μg/ml洋地黄素和20 mM钙²⁺或5 mM EGTA）。注意表达TRPP2（橙色虚线）的单元格中的稳态值降低。(C类)稳定态钙²⁺ER中的浓度（[Ca²⁺]_急诊室)根据（B）中描述的一系列实验计算出的对照细胞和表达TRPP2的细胞(n个分别为16和18）。(D类)以线粒体为靶点的骆驼（YC4.1_米托)在HeLa细胞中表达（比例尺：10μm）。(E类)YC4.1的荧光发射比（535/480nm）_米托在转染TRPP2或空载体（对照）（10μM组胺）的细胞中记录。(F类)峰值Ca时（E）的分组数据²⁺增加。

图5
MDCK细胞中TRPP2的消融降低ER-Ca²⁺泄漏并导致可释放钙量增加²⁺. (A类)条件表达MDCK细胞的分析*TRPP2型*-靶向（TRPP2 kd）或对照shRNA盒，以及GFP标记。通过western blotting分析在没有（−tet）和存在（+tet）四环素的情况下生长的细胞制备的裂解物。GFP的诱导表达也通过荧光显微镜观察到（绿色）。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。比例尺：10μm。(B类)Fura-2胞质钙²⁺在缺乏细胞外钙的情况下，用2μM离子霉素（Iono）处理TRPP2缺失细胞（TRPP2 kd）和对照细胞后的成像²⁺显示了代表性记录道和组数据（峰值-基线；n个=7). (C类)除使用10μM ATP外，实验与（B）相同(n个=6). (D类)western blotting分析对照组和TRPP2 kd细胞裂解液中SERCA2和Bcl-2的水平。(E类)用低亲和力钙负载MDCK细胞²⁺指示剂Mag-Fur-2AM和洋地黄素渗透分析钙的动力学²⁺泵入ER及其泄漏。图片显示了渗透（a）后定位于细胞内储存物中的Mag-Fura-2（340 nm波长激发）的荧光及其钙²⁺（b）和（c）重新填充之前和之后的加载状态（340/380nm比率以假彩色表示）。(F类)图表显示了Ca的变化²⁺细胞内储存物的负载状态（340/380nm比率*R（右）*除以最小比率*R（右）*₀)在对照组和TRPP2缺失（TRPP2 kd）细胞中。通过添加1.5 mM ATP和Ca开始重新加注²⁺30μM CPA抑制SERCA后观察到泄漏。最小比率*R（右）*₀在用离子霉素（Iono；2μM）耗尽库存后发现。(**G公司**)ER再填充和泄漏的统计分析n个=64个控制单元和n个=64个TRPP2-分别来自六个和七个独立测量的缺失细胞。每个细胞的钙渗漏率与*R（右）*/*R（右）*₀在CPA治疗开始时，用Excel软件将数据拟合成线性回归线(年=*bx公司*+一，其中b条为0.0054，一为−0.005，相关性第页=0.835（对于对照细胞）；b条为0.0038，一为−0.0032，并且第页=0.661（对于TRPP2缺失的细胞）。左边的条形图显示了两个回归斜率之间的差异及其标准误差(*P（P）*=0.025). 其余的条形图显示了泄漏和重新填充的平均速率及其标准误差。

图6
TRPP2的消融使细胞对神经酰胺而非放线菌素D诱导的凋亡敏感(A类)用10或20μM C诱导凋亡后，检测TRPP2缺失（TRPP2 kd；灰色条）和对照（黑色条）MDCK细胞中caspase 3样活性₂-神经酰胺6或9小时。活性以每分钟相对荧光单位（RFU）表示，并标准化为1mg总蛋白(n个=4). (B类)用指定剂量的C₂-通过ELISA测量神经酰胺，并将其标准化为细胞裂解物中的总蛋白水平。条形图显示了一个代表性测量的数据。该试验重复三次，结果基本相同。(C类)用0.5μg/ml放线菌素D（ActD）诱导TRPP2耗竭细胞和对照细胞凋亡9小时。测量胱天蛋白酶3样活性，如（A）所示(n个=3).

图7
ER-Ca的简化模型²⁺通向凋亡的大门。在生理条件下，Ca²⁺内质网和线粒体之间持续循环²⁺ATP酶（SERCA）泵Ca²⁺通过IP从ER释放_三-选通信道（IP_三R） ●●●●。美国加利福尼亚州²⁺单转运蛋白（mCU）介导Ca²⁺线粒体和线粒体钠的摄取⁺/钙²⁺交换器（mNCE）释放Ca²⁺.凋亡刺激可释放钙²⁺来自内质网，导致线粒体钙²⁺信号。线粒体Ca的大小²⁺信号和额外的促凋亡刺激决定细胞色素*c（c）*释放以触发细胞凋亡。线粒体Ca的振幅²⁺信号取决于Ca²⁺内质网的含量，由活性钙之间的平衡维持²⁺SERCA和被动Ca泵送²⁺从ER退出。TRPP2和Bcl-2降低Ca²⁺ER中的浓度（[Ca²⁺]_急诊室)通过增加被动钙²⁺退出通道。这导致线粒体钙降低²⁺信号，导致对凋亡的敏感性降低。根据“变阻器模型”（Demaurex和Distelhorst，2003），ER Ca²⁺负荷由抗凋亡和促凋亡Bcl-2蛋白家族成员（分别为Bcl-2和Bax/Bak）之间的平衡调节。在这里，我们介绍了阳离子通道TRPP2作为该模型中的一种新型抗凋亡因子（根据Demaurex和Distelhorst的综述修改，2003年）。

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