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.2009年9月；41(3):332-8.
doi:10.1165/rcmb.2008-0288OC。 Epub 2009年1月16日。

血清反应因子在TGF-β诱导肺肌成纤维细胞分化中的关键作用

内森·桑博 1, 史蒂文·克雷格尔, 塞巴斯蒂安·陶林, Sangeeta Bhorade公司, 尼克莱·O·都林
附属公司

血清反应因子在TGF-β诱导肺肌成纤维细胞分化中的关键作用

内森·桑德博等。 美国呼吸细胞分子生物学杂志. 2009年9月.

摘要

转化生长因子-β（TGF-β）是一种与伤口愈合和肺纤维化发病机制有关的细胞因子。TGF-β刺激肌成纤维细胞分化，其特征是可收缩平滑肌（SM）特异蛋白的表达，如SM-α-肌动蛋白。在本研究中，我们检测了血清反应因子（SRF）在TGF-β诱导人肺成纤维细胞（HLF）肺肌成纤维细胞分化机制中的作用。TGF-β刺激HLF中SM-alpha-actin的表达，这与深刻诱导SRF的表达和活性平行。药物性SRF抑制剂（CCG-1423）或通过腺病毒介导的SRF短发夹RNA（shSRF）转导抑制SRF，阻断SRF和SM-alpha-actin对TGF-β的反应表达，而不影响Smad介导的TGF-α信号传导。然而，强制表达SRF本身并不能促进SM-alpha-actin的表达，而组成性反式激活SRF融合蛋白（SRF-VP16）的表达足以诱导SM-alpha-actin表达，这表明SRF的表达和反式激活都很重要。forskolin或iloprost激活蛋白激酶A（PKA）可显著抑制TGF-β诱导的SM-alpha-actin表达，这与抑制SRF表达和活性有关，但与Smad-mediated基因转录无关。总之，这是首次直接证明TGF-β诱导的肺肌成纤维细胞分化是由SRF介导的，并且PKA对肌成纤维细胞分化的抑制是通过下调SRF表达水平和SRF活性而发生的，与Smad信号无关。

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数字

<b>图1</b>
图1。
转化生长因子（TGF）-β诱导的平滑肌（SM）-α-肌动蛋白的表达伴随着血清反应因子（SRF）的表达和激活。(A类)将人肺成纤维细胞生长至低通量，血清饥饿过夜，并用2 ng/ml TGF-β刺激指定的时间。用所示的抗SM–α-actin、SRF或β-actin抗体对细胞提取物进行Western blotting分析。(B类)将亚流入的人肺成纤维细胞转染SRF-萤火虫荧光素酶报告子（SRF-luc）、胸腺嘧啶激酶驱动的肾小球荧光素素酶（TK-RL）对照报告子和血清饥饿过夜，然后用载体（C）或2 ng/ml TGF-β刺激24小时。然后，在细胞裂解液中测量萤火虫荧光素酶（SRF-Luc）的活性，并将其归一化为肾小球荧光素酶（TK-RL）的活性。数据表示三次实验的结果，一式三份。
<b>图2</b>
图2。
药物性SRF抑制剂CCG-1423下调SM–α-actin和SRF表达。(A类)用10μM CCG-1423预处理血清饥饿的人肺成纤维细胞1小时，然后用2 ng/ml TGF-β刺激48小时。通过Western blotting分析细胞提取物，并根据指示使用针对SM–α-actin、SRF、Smad2、Smad4或β-actin的抗体。(B类)用10μM CCG-1423预处理血清饥饿的人肺成纤维细胞1小时，然后用2 ng/ml TGF-β刺激指定时间。通过Western blotting分析细胞提取物与抗磷酸化S-mad2（Ser465/Ser467）、总Smad2或β-肌动蛋白的抗体。
<b>图3</b>
图3。
SRF敲除下调SM–α-actin表达。用表达抗SRF短发夹RNA的重组缺陷型腺病毒（Ad-shSRF）或在0.1%牛血清白蛋白中表达抗GFP短发夹病毒（Ad-shGFP）的对照腺病毒转导亚流入的人肺成纤维细胞48小时，然后用2 ng/ml TGF-β刺激细胞48小时。通过Western blotting分析细胞提取物与SRF、SM–α-actin、Smad2、Smad4或β-actin抗体，如图所示。
<b>图4</b>
图4。
SRF的过度表达本身不足以驱动SM–α-actin的表达。用空白载体或对照载体cDNA（pcDNA3.1）、GFP标记的野生型SRF、组成活性SRF-VP16融合蛋白或GAL4-VP16融合蛋白质转染HT-1080细胞48小时。采用免疫印迹法对细胞提取物进行分析，并根据指示使用抗SRF、SM–α-actin或β-actin抗体。注意，针对SRF C末端的SRF抗体不能识别SRF-VP16，因为SRF的C末端反激活域被病毒共激活物VP16的反激活域所取代（25）。
<b>图5</b>
图5。
cAMP提剂抑制TGF-β诱导的SMα-actin和SRF表达。(A类)用10μM毛喉素（FSK）预处理血清饥饿的人肺成纤维细胞15分钟，然后用2 ng/ml TGF-β刺激48小时。采用免疫印迹法对细胞提取物进行分析，并根据指示使用抗SRF、SM–α-actin或β-actin抗体。(B类)用10μM FSK预处理血清饥饿的人肺成纤维细胞15分钟，然后用2 ng/ml TGF-β刺激30分钟。通过Western blotting分析细胞提取物与磷酸化S-mad2（Ser465/Ser467）、总Smad2、血管扩张剂刺激的磷酸蛋白（VASP）或β-肌动蛋白的抗体。VASP的电学迁移率随着其被PKA磷酸化而发生变化（21）。(C类)用10μM伊洛前列素（Ilo）预处理血清饥饿的人肺成纤维细胞15分钟，然后用2 ng/ml TGF-β刺激48小时。采用免疫印迹法对细胞提取物进行分析，并根据指示使用抗SRF、SM–α-actin或β-actin抗体。
<b>图6</b>
图6。
PKA通过抑制SRF而非Smad-binding elements（SBE）来调节TGF-β诱导的SMα-actin启动子激活。用荧光素酶报告子转染人肺成纤维细胞，获得−764碱基对(A类)SM–α-肌动蛋白启动子(B类)SRF-荧光素酶报告子，或(C类)SBE-荧光素酶报告子和胸腺嘧啶激酶驱动肾小球（TK-RL）对照报告子。用10μM FSK预处理血清饥饿细胞15分钟，然后用2 ng/ml TGF-β刺激24小时。然后在细胞裂解液中测量荧光素酶的活性，并将其归一化为肾小球的活性。数据表示至少三次实验的结果，一式三份(*P（P）< 0.05).
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