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.2009年1月1日；23(1):24-36.
doi:10.10101/gad.1735809。

GLI1通过肿瘤性胰腺导管中平滑的非依赖机制进行调节，并调节PDAC细胞的存活和转化

奥利维尔·诺兰·斯特沃 1, 珍妮特·刘, 摩根·L·特鲁伊特, 杰拉尔德·朱棣文, 马提亚斯·希布罗克, 马丁·费尔南德斯·扎皮科, 哈纳汗
附属公司

GLI1通过肿瘤性胰腺导管中平滑的非依赖机制进行调节，并调节PDAC细胞的存活和转化

奥利维尔·诺兰·斯特沃等。 基因开发. .

摘要

胰腺导管腺癌（PDAC）的特征是对刺猬信号通路的放松调控。正常胰腺中缺失的Sonic Hedgehog配体（Shh）在胰腺肿瘤中高度表达，足以在小鼠模型中诱导肿瘤前体病变。我们通过基因消融PDAC易感小鼠胰腺上皮中刺猬信号传递的典型瓶颈，即跨膜蛋白Smoothened（Smo），来研究Shh信号在PDAC癌变中的机制。我们的报告显示，胰腺中Smo的缺失不会影响PDAC肿瘤的多阶段发展，这表明胰腺导管细胞中的Shh-Ptch-Smo自分泌信号对PDAC的发展不是必需的。然而，Gli靶基因的表达维持在Smo-negative导管中，这意味着在肿瘤导管上皮中调节Gli转录的替代方法。在PDAC肿瘤细胞中，我们发现Gli转录与上游Shh-Ptch-Smo信号解耦，并受TGF-β和KRAS调节，我们表明Gli1对培养的PDAC癌细胞的生存和KRAS-介导的转化表型都是必需的。

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数字

图1。
图1。
刺猬通路成分在PDAC病变中被解除调控。(A类)的表达式嘘,第1部分,平滑（Smo）、和Gli1公司～12周龄总RNA提取物中的mRNALSL克拉斯/+;第53页如果/+对照胰腺（P）(N个=3）或p48芯/+;LSL-Kras公司/+;p53基因F类/+肿瘤（T）(N个=3）。mRNA水平表示为米格斯控制mRNA。星号表示P（P）-值<0.01。(B类,C类)Shh（50×）的免疫化学检测。(B类)正常胰腺未见Shh。(C类)在9周龄PDAC小鼠的PanIN病变的导管细胞内检测到Shh表达。这些面板代表了两个对照组和两个PDAC小鼠的多个胰腺切片区域。
图2。
图2。
PDAC Smo导管细胞中的Smoothed被耗尽前/后老鼠。(A类)重组平滑（Smo）PDAC细胞系中的位点。PCR扩增平滑（Smo）基因座（Smo）或p48-Cre转基因（p48）。这个平滑（Smo）基因分型程序放大非结合条件平滑（Smo）F类等位基因（上带，F）和野生型（wt）平滑（Smo）等位基因（低带，野生型）。当Cre重组平滑（Smo）条件位点。每个PCR反应中使用的输入基因组DNA表示为：（Tail）来自小鼠尾部的基因组DNA，100 ng；PDAC衍生肿瘤细胞系（细胞）基因组DNA，10 ng；(+/+)平滑（Smo）+/+; （F/+）平滑（Smo）如果/+; （前/后）平滑（Smo）前/后. (B类)耗尽平滑（Smo）mRNA在重组细胞系中的表达。总RNA提取物中Smo mRNA的表达平滑（Smo）+/+（W） ，平滑（Smo）如果/+（H） ，或平滑（Smo）前/后（F） PDAC细胞系。mRNA水平以m-Gus对照mRNA的百分比表示。对每个基因型的两个细胞系的总RNA提取物进行三次分析。(C类)体内重组平滑（Smo）轨迹。通过激光捕获显微切割（LCM）从PDAC肿瘤中分离出的导管结构或间质区域的基因组DNA进行与A类将每个基因型的两个PDAC肿瘤的导管或间质区合并，并进行PCR扩增。每个PCR反应中使用的输入基因组DNA表示为：（尾部）来自小鼠尾部的DNA；（导管）两个PDAC肿瘤的LCM捕获导管；（基质）LCM捕捉到两个PDAC肿瘤的基质丰富区；（+/+）平滑+/+; （F/+）平滑如果/+; （F/F）平滑前/后. (D–G型)体内Smo蛋白耗竭。Smo（绿色）和Muc-1（红色）的免疫荧光检测（630×）。在PDAC Smo内的一组粘蛋白阴性导管中检测到Smo蛋白如果/+PanIN样病变(天)但不存在于粘蛋白阳性导管（白色箭头）和粘蛋白阴性PDAC Smo中如果/+腺癌病变(电子). 在PDAC Smo中检测不到Smo前/后PanIN样病变(F类)或PDAC Smo前/后腺癌(G公司). 单个PDAC Smo的颗粒细胞质Smo染色如果/+电池（2520×）(天,插入)个人PDAC Smo中缺失前/后单元格(F类,插入). 这些面板代表了三个PDAC Smo胰腺切片的多个区域如果/+小鼠和三个PDAC Smo前/后老鼠。
图3。
图3。
在缺乏Smo功能的情况下，胰腺导管和腺泡发育正常。(A类)定量RT-PCR比较平滑（Smo）12.5-d分离胰腺芽总RNA提取物中的mRNAPdx-Cre公司;平滑（Smo）+/+（平滑+)胚胎和Pdx-Cre；平滑（Smo）F/空（平滑−)胚胎。(B类,C类)胰腺切片的抗Muc1和抗α-淀粉酶染色Pdx-Cre公司;平滑（Smo）+/+老鼠(B类)和Pdx-Cre公司;平滑（Smo）F类/无效的老鼠(C类). (天)胰腺切片的H&E染色Pdx-Cre公司;平滑（Smo）+/+小鼠和Pdx-Cre；平滑（Smo）F/空老鼠。箭头表示胰腺导管。这些面板代表了两个胰腺切片的多个区域Pdx-Cre公司;平滑（Smo）+/+和两个Pdx Cre公司;平滑（Smo）F类/无效的老鼠。
图4。
图4。
胰腺上皮中Smo的遗传缺失并不影响PDAC肿瘤的发生。(A–D)组织病理学的H&E分析PDAC烟雾如果/+(A类,C类)和PDAC Smo公司前/后(B类,天)病变显示PanIN样病变的表现无明显差异(A类,B类)或PDAC(C类,天). (电子)PDAC Smo的胰腺重量无显著差异如果/+小鼠（F/+；N个=10）和PDAC Smo前/后小鼠（F/F；N个=11）可以检测到[（**）P（P）=0.378）]，但在荷瘤小鼠和对照非荷瘤小鼠的胰腺重量之间观察到显著差异[N个= 13; (*)P（P）< 0.01]. (F类)PDAC Smo队列的平均生存率如果/+小鼠（绿线；N个=31）显著大于[17天；（*）P（P）与PDAC Smo相比，<0.05]前/后小鼠（红线；N个= 31). 这些面板代表了八个PDAC Smo胰腺切片的多个区域如果/+老鼠和八只PDAC Smo前/后老鼠。(G公司)体外重组平滑（Smo）源自非融合PDAC 4.2 NR细胞系的PDAC 4.2 R细胞系中的基因座。PCR扩增平滑（Smo）轨迹（Smo）或Betacellulin公司控制轨迹(生物技术委员会).平滑（Smo）基因分型：未重组平滑（Smo）F类等位基因（上带，F）和野生型平滑（Smo）等位基因（低带，野生型）。当Cre重组平滑（Smo）条件位点。输入的基因组DNA表明：（尾部）来自小鼠尾部的基因组DNA；（4.2NR）来自未合并的PDAC细胞系的基因组DNA；（4.2R）来自体外重组PDAC细胞系的基因组DNA。(小时)直接注射4.2NR的裸鼠胰腺肿瘤平均重量(N个=8，平滑+)或4.2 R电池(N个=8，烟雾−). 未检测到显著差异。(我,J)4.2 NR的H&E染色（Smo+)和4.2 R（Smo−)异种移植瘤切片。这些面板代表了四个4.2 NR和四个4.2 R胰腺肿瘤的多个胰腺切片区域。
图5。
图5。
第1部分和Gli1公司在体内Smo缺失的肿瘤导管细胞中保持表达。(A类,B类)胰管激光显微切割术前(A类)以及之后(B类)在H&E染色的冰冻肿瘤切片上捕获（50×）。(C类)的表达式平滑（Smo）,第1部分,嘘、和Gli1公司从两个PDAC Smo的激光捕获微细切割胰腺管池中提取的总RNA中的mRNA+/+（W） ，两个PDAC Smo如果/+（H） 和两个PDAC Smo前/后（F） 肿瘤。mRNA水平以m-Gus对照mRNA的百分比表示(天)在原代胰腺成纤维细胞（F）或PDAC细胞系3.3（P）中增加重组Shh浓度（0–50–150–500 ng/mL）刺激后，Hedgehog/Gli信号成分的相对表达（%mGus）。星号表示P（P）值<0.01(C类)或<0.001(天).
图6。
图6。
TGF-β和激活的Kras信号影响格利和第1部分以Smo-independent方式表达。(A类)的表达式平滑（Smo）,第1部分,E-Cad、Gli1、和Gli3公司野生型总RNA提取物中的mRNA平滑（Smo）（4.2 NR）或平滑（Smo）用5 ng/mL重组TGF-β1刺激突变型（4.2R）PDAC细胞48小时后。mRNA水平表示为米格斯控制mRNA(B类)的表达式喀斯特,Gli1公司、和第1部分野生型总RNA提取物中的mRNA平滑（Smo）（4.2 NR）或平滑（Smo）用对照siRNA池或靶向siRNA池转染48小时后的突变体（4.2R）PDAC细胞喀斯特或Gli1公司.mRNA水平表示为米格斯控制mRNA(C类)转染对照siRNA池或靶向siRNA池72小时后，用MTT（见材料和方法）孵育的两种PDAC细胞系（4.2 NR和3.3）在540nm处的吸光度喀斯特或Gli1公司血清饥饿24h后。(天)用对照siRNA池（Ctrl）或靶向siRNA池转染小鼠PDAC 3.3细胞60 h后，活化Caspase 3免疫荧光染色的相对变化喀斯特或Gli1，血清饥饿12小时后。在五个区域评估染色情况，每个区域至少包含500个细胞。Act-Casp-3阳性细胞表达为DAPI细胞核的百分比；Ctrl处理细胞的百分比设置为100%。星号表示P（P）-值<0.01(A类), <0.05 (B类,C类)，或<0.005(天).
图7。
图7。
GLI1型是生存和维持人类PDAC癌细胞转化表型所必需的。(A类)L3.6、PANC1、MiaPaCa2和BxPC3胰腺癌细胞转染后48 h染色质凝集/边缘化和核碎裂（代表凋亡）的相对变化第1页或干扰控制shRNA，然后用25 mM环己酰亚胺进行处理。统计了四个高功率场中的300多个细胞；凋亡细胞表示为总细胞的百分比。(B类)转染干扰shRNA的L3.6 PDAC细胞的Hoescht 33342染色，第1页，或第1页旁边有一个第1页-抵抗的GLI1型cDNA构建(rGLI1型). 箭头表示表示凋亡的核形态模式（蓝色，Hoechst 33342）。(C类)转染后检测L3.6、PANC1、MiaPaca2和BxPC3胰腺癌细胞的相对集落形成（非肿瘤性凤尾鱼生长）第1页或扰乱shRNA（对照）质粒。(天)BxPC3胰腺癌细胞的相对集落形成（野生型KRAS公司)转染致癌基因KRAS公司和加扰对照shRNA，shGli1型，或shGli1型旁边有一个第1页-抵抗的GLI1型cDNA拯救构建体(rGli1基因). (电子)相对变化荧光素酶转染Gli-Luciferase报告子的L3.6、PANC1、MiaPaCa2和BxPC3胰腺癌细胞中的活性shKRAS公司或加扰控制shRNA(F类)相对变化荧光素酶BXPC3活性（野生型KRAS公司)a转染胰腺癌细胞GLI-荧光素酶有或没有记者KRAS公司或GLI1型表达式构造。（*）P值<0.01；（**）P值<0.05。
图8。
图8。
胰腺导管癌发生中功能显著的刺猬信号和GLI转录的新概念。(A类)PDAC中Hh/Gli信号的传统模型。早期研究表明，SHH配体的自分泌信号在PDAC细胞中具有重要功能（绿色箭头）。体内可能向基质发出信号是一个未经验证的假设（黑色虚线箭头），癌细胞和基质细胞（如癌相关成纤维细胞）中的刺猬信号被认为遵循标准刺猬的信号，SHH与PTCH结合并诱导SMO信号传导，从而导致活性GLI转录因子的核移位和GLI靶基因的转录激活，如GLI1型和PTCH1型. (B类)PDAC中Hh/Gli信号的改进模型。我们的研究表明PDAC肿瘤细胞（1）需要GLI1型为了转化和存活，（2）不通过SMO共受体（交叉灰色箭头）转导功能显著的SHH配体信号，（3）继续表达GLI公司转录靶点独立于SMO公司通过部分由KRAS（橙色箭头）和TGFβ（紫色箭头）介导的GLI靶基因的非经典调节。与PDAC癌细胞中的非经典GLI转录类似，癌细胞产生的SHH以旁分泌方式（绿色箭头）向周围的间质发出信号，并可能在PDAC发病机制中发挥关键的旁分泌功能（Yauch等人，2008年）。为了应对SHH，成纤维细胞分泌可能刺激肿瘤细胞生长的信号分子（Yauch等人，2008年）（黑色虚线箭头）。
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