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.2009年1月5日6:1。
doi:10.1186/1742-2094-6-1。

β淀粉样低聚物和原纤维刺激初级小胶质细胞的差异活化

辛迪·桑达 1, Gunjan Dhawan公司, 科林·K·库姆斯
附属公司

β淀粉样低聚物和原纤维刺激初级小胶质细胞的差异活化

辛迪·桑达等。 J神经炎症. .

摘要

背景：β-淀粉样肽（Abeta）是阿尔茨海默病患者大脑中老年斑的主要成分。发病机制与肽的聚集形式有关，因为这些纤维是斑块中容易发现的构象。然而，最近的研究表明，Abeta的非聚集、可溶性组装体有可能刺激神经元功能障碍，并可能在阿尔茨海默病的发病机制中发挥重要作用。

方法：制备了可溶的合成Abeta1-42低聚物，主要产生SDS-PAGE评估的二聚体构象。类似的分析表明，纤维制备会产生无法从凝胶堆积部分迁移出来的大的不溶性聚集物。这些肽制剂用于刺激原代小鼠小胶质细胞和皮层神经元培养。通过Western分析和ELISA分析小胶质细胞的信号反应和分泌表型变化。通过定量培养物中乳酸脱氢酶的释放来检测活性。

结果：阿贝塔寡聚物和纤维用于刺激小胶质细胞进行比较。寡聚物和原纤维都刺激了原发性小胶质细胞的促炎激活，但肽的特殊构象决定了激活特征。与原纤维相比，低聚物刺激活性磷酸化Lyn和Syk激酶以及p38 MAP激酶水平的增加。此外，与原纤维相比，低聚物刺激了白细胞介素6、单核细胞趋化蛋白-1和角质形成细胞趋化因子的差异分泌。最后，可溶性低聚物刺激培养的皮层神经元死亡，而小胶质细胞的存在加剧了这种死亡。

结论：这些数据表明，纤维和低聚物刺激小胶质细胞中独特的信号反应，导致离散的分泌变化和对神经元存活的影响。这表明疾病期间的炎症变化可能是独特的肽刺激事件的结果，每个构象可能代表一个单独的抗炎治疗靶点。

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数字

图1
图1
寡聚物和纤维Aβ刺激酪氨酸磷酸化蛋白水平的质的相似和剂量依赖性增加Aβ1–42低聚物（Aβo）和Aβ1-42原纤维（Aβf）通过4度过夜培养（Aβo）或37度培养7天（Aβf）制备至100μM浓度，然后在DMEM/F12培养基中稀释至20μM，并在37℃下再培养48小时，以确定生物测定条件下的肽状态。用（A，B）15%SDS-PAGE或（C）15%非变性凝胶电泳分离1μg（A，C）或0.2–2μg（B）肽，并用抗Aβ抗体6E10进行Western blot。（D） 或者，将制备的Aβo和Aβf分别点印在PVDF上（5μg），并用抗Aβ抗体6E10或抗低聚物抗体A11进行印迹。（E） 未刺激（对照）原代小鼠小胶质细胞，或通过增加Aβo、Aβf或载体的浓度刺激。5分钟后用RIPA缓冲液溶解细胞。通过7%SDS-PAGE分离细胞裂解物，并用抗磷酸酪氨酸抗体（4G10）和抗ERK2抗体（负载对照）进行蛋白质印迹。通过化学发光观察抗体结合。印迹是至少三个独立实验的代表。
图2
图2
Aβ1–42刺激构象特异性MAP和酪氨酸激酶信号反应，同时增加COX-2和CD68蛋白水平未刺激（对照）或用20μM Aβo或20μM Bβf刺激原代小鼠小胶质细胞。（A）用RIPA缓冲液5分钟后裂解细胞，用10%SDS-PAGE分离裂解产物，并用抗磷酸酪氨酸抗体（4G10）、抗磷酸JNK抗体、抗JNK抗抗体（负荷控制）、抗磷化ERK抗体、，抗ERK2抗体（负荷控制）、抗磷酸p38抗体、抗p38抗体（负荷控制器）、抗磷-Lyn抗体或抗Lyn抗体（负荷对照）。（B） 5分钟后用RIPA缓冲液溶解细胞，免疫沉淀Syk。免疫沉淀物用7%SDS-PAGE分离，并用抗磷酸酪氨酸抗体（4G10）和抗Syk抗体进行Western blot。箭头将特异性免疫反应与IgG重链区分开来。（C） 24小时后用RIPA缓冲液溶解细胞。通过10%SDS-PAGE分离细胞裂解物，并用抗COX-2抗体、抗CD68抗体、抗CD45抗体和抗ERK2抗体（负载对照）进行Western印迹。化学发光法显示抗体结合。印迹是至少三个独立实验的代表。
图3
图3
Aβ1–42刺激促炎细胞因子和趋化因子分泌的构象特异性增加用20μM Aβo、20μM Bβf或25 ng/mL脂多糖（LPS，阳性对照）刺激原代小胶质细胞24小时。（A） 收集培养基并用于对小鼠炎症抗体阵列进行初步筛选，以评估是否出现分泌的相对差异。为了定量选择变化，收集培养基并通过（A）小鼠IL-6 ELISA、（B）小鼠KC ELISA或（C）小鼠MCP-1 ELISA进行分析。数据通过非配对方差分析（ANOVA）和Tukey的测试后比较进行分析，并表示为平均值+/-SD。这些值代表了三个独立实验（*=p<0.05，**=p<0.001，**=p<0.001（低聚物），#=p<0.00（纤维））。
图4
图4
Aβ1–42寡聚体在神经元-小胶质细胞共培养中仅具有神经毒性.(A） 原发性小胶质细胞，（B）14天在体外随着Aβo、Aβf或载体剂量的增加，未刺激（对照）或刺激原代皮层神经元或（C，D）原代神经元-小胶质细胞共培养24（A-C）或48（D）小时。收集培养基并通过（A-C）LDH释放试验进行分析，以评估生存能力。数据通过非配对方差分析（ANOVA）和Tukey的测试后比较进行分析，并表示为平均值+/-SD。这些值代表了三个独立实验（对照组*=p<0.05，对照组**=p<0.001，Aβf+神经元***=p<0.01）。（D） 或者，刺激后固定神经元，对MAP2表达进行免疫染色，并计数以评估存活率。数据通过非配对方差分析和Tukey的测试后比较进行分析，表示为平均+/-SEM，代表三个独立实验。（小胶质细胞+神经元的*=p<0.01，小胶质细胞=神经元的**=p<0.001）。
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