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.2008年12月；6(12):1946-56.
doi:10.1158/1541-7786.MCR-07-2197。

激酶b2受体介导环氧合酶-2的诱导并在头颈部鳞状细胞癌中过度表达

张卫平 1, 尼尔·波拉, Shailaja Kalyankrishna公司, 威廉·古丁, 珍妮佛亨特, 拉贾·西塔拉, 詹妮弗·格兰迪斯, 吉尔·M·齐格弗里德
附属公司

激酶b2受体介导环氧合酶-2的诱导并在头颈部鳞状细胞癌中过度表达

张伟平等。 摩尔癌症研究. 2008年12月.

摘要

缓激肽已被证明通过表皮生长因子受体（EGFR）反式激活促进头颈部鳞癌（HNSCC）细胞的生长和迁移。也有报道称，缓激肽可以通过人气道细胞中的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径诱导环氧合酶-2（COX-2），这是一种原癌酶。为了确定缓激肽是否上调HNSCC中COX-2的表达，本研究研究了缓激肽诱导的人HNSCC细胞EGFR反式激活、MAPK激活和COX-2表达。缓激肽诱导HNSCC中COX-2蛋白的浓度和时间依赖性诱导，之前是EGFR和MAPK的磷酸化。B2受体（B2R）拮抗剂HOE140可消除这些效应，但B1受体（B1R）拮抗物Lys-[Leu（8）]des-Arg（9）-缓激肽则不能消除这些效应。COX-2诱导伴随着前列腺素E（2）的释放增加。未观察到B1R激动剂（des-Arg（9）-缓激肽）对p-MAPK或COX-2表达的影响。B2R蛋白在所有四个测试的头颈部细胞系中都有表达。免疫组织化学分析和免疫印迹分析显示，与同一患者的正常粘膜中的水平相比，B2R（而不是B1R）在HNSCC肿瘤中显著过表达。在HNSCC细胞中，缓激肽诱导的COX-2表达被EGFR激酶抑制剂吉非替尼或丝裂原活化蛋白激酶抑制剂（PD98059或U0126）抑制。这些结果表明，缓激肽诱导COX-2需要EGFR和MAPK。头颈癌中B2R的上调表明，该途径参和了HNSCC肿瘤的发生。

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数字

图1
图1。BK诱导HNSCC细胞COX-2表达
（A） COX-2表达对BK浓度的依赖性。对PCI-37A细胞进行48小时的血清饥饿处理，然后在收获前用增加浓度的BK（0.1-1000 nM）处理2小时。（B） BK诱导COX-2表达的时间进程。将PCI-37A细胞缺血清48小时，然后用10 nM BK处理指定的时间间隔。（C） BK诱导UM-22B和1483 HNSCC细胞株中COX-2表达。对UM-22B和1483细胞进行48小时的血清饥饿处理，然后在收获前用增加浓度的BK（0.1-100 nM）处理2小时。制备全细胞裂解物，然后用COX-2和β-肌动蛋白的Abs免疫印迹。显示了具有代表性的免疫印迹。该图显示了通过密度测定法（三个独立实验的累积结果）测定的蛋白质水平与对照组相比的折合变化，并与每个栏正上方显示的车道相关联。数据表示为平均值±SE。符号*表示P（P）与对照组相比<0.05。
图1
图1。BK诱导HNSCC细胞COX-2表达
（A） COX-2表达对BK浓度的依赖性。对PCI-37A细胞进行48小时的血清饥饿处理，然后在收获前用增加浓度的BK（0.1-1000 nM）处理2小时。（B） BK诱导COX-2表达的时间进程。将PCI-37A细胞缺血清48小时，然后用10 nM BK处理指定的时间间隔。（C） BK诱导UM-22B和1483 HNSCC细胞株中COX-2表达。对UM-22B和1483细胞进行48小时的血清饥饿处理，然后在收获前用增加浓度的BK（0.1-100 nM）处理2小时。制备全细胞裂解物，然后用Abs对COX-2和β-肌动蛋白进行免疫印迹。显示了具有代表性的免疫印迹。该图显示了通过密度测定法（三个独立实验的累积结果）测定的蛋白质水平与对照组相比的折合变化，并与每个栏正上方显示的车道相关联。数据表示为平均值±SE。符号*表示P（P）与对照组相比<0.05。
图1
图1。BK诱导HNSCC细胞COX-2表达
（A） COX-2表达对BK浓度的依赖性。对PCI-37A细胞进行48小时的血清饥饿处理，然后在收获前用增加浓度的BK（0.1-1000 nM）处理2小时。（B） BK诱导COX-2表达的时间进程。将PCI-37A细胞缺血清48小时，然后用10 nM BK处理指定的时间间隔。（C） BK诱导UM-22B和1483 HNSCC细胞系中COX-2的表达。对UM-22B和1483细胞进行48小时的血清饥饿处理，然后在收获前用增加浓度的BK（0.1-100 nM）处理2小时。制备全细胞裂解物，然后用Abs对COX-2和β-肌动蛋白进行免疫印迹。显示了具有代表性的免疫印迹。该图显示了通过密度测定法（三个独立实验的累积结果）测定的蛋白质水平与对照组相比的折合变化，并与每个栏正上方显示的车道相关联。数据表示为平均值±SE。符号*表示P（P）与对照组相比<0.05。
图2
图2。BK诱导PGE的时间过程2释放
将PCI-37A细胞无血清培养48小时，然后在37°C下用10 nM BK处理指定的时间间隔。收集细胞培养液，并使用50μl等分样品测量PGE2使用ELISA试剂盒（Cayman Chemicals）进行释放。结果为三个独立实验的平均值±SE。符号*表示P（P）与对照组相比<0.05。
图3
图3。BK诱导的MAPK磷酸化
（A） MAPK激活对BK浓度的依赖性。将PCI-37A细胞无血清培养48小时，然后在收获前用增加浓度的BK（0.1-1000 nM）处理10分钟。（B） BK诱导p-MAPK的时间进程。将PCI-37A细胞缺血清48小时，然后用10 nM BK处理指定的时间间隔（0-8小时）。制备全细胞裂解物，然后用Abs免疫印迹p-MAPK和总MAPK。显示了具有代表性的免疫印迹。该图显示了通过密度测定法（三个独立实验的累积结果）测定的蛋白质水平与对照组相比的折合变化，并与每个栏正上方显示的车道相关联。所示数据为平均值±SE。符号*表示P（P）与对照组相比<0.05。
图3
图3。BK诱导的MAPK磷酸化
（A） MAPK激活对BK浓度的依赖性。将PCI-37A细胞无血清培养48小时，然后在收获前用增加浓度的BK（0.1-1000 nM）处理10分钟。（B） BK诱导p-MAPK的时间进程。将PCI-37A细胞血清饥饿48小时，然后用10nM BK处理指定的时间间隔（0-8小时）。制备全细胞裂解物，然后用Abs免疫印迹p-MAPK和总MAPK。显示了具有代表性的免疫印迹。该图显示了通过密度测定法（三个独立实验的累积结果）测定的蛋白质水平与对照组相比的折合变化，并与每个栏正上方显示的车道相关联。所示数据为平均值±SE。符号*表示P（P）与对照组相比<0.05。
图4
图4。BK诱导的EGFR、MAPK磷酸化和COX-2表达是通过B2缓激肽受体介导的，而不是B1缓激肽接收器介导的
（A） BK受体拮抗剂存在时BK诱导EGFR磷酸化。（B） BK在BK受体拮抗剂存在下诱导MAPK磷酸化。（C） BK受体拮抗剂存在时BK诱导COX-2表达。PCI-37A细胞被剥夺血清3天，用一系列浓度的B1受体拮抗剂Lys-（Des-Arg9-卢8)-按照指示使用BK或B2-受体拮抗剂HOE140治疗1小时，然后使用50 nM BK治疗5分钟以检测磷酸-EGFR和磷酸-MAPK，使用10 nM BK治疗2小时以测量COX-2。制备全细胞裂解物，并使用材料和方法中描述的特定抗体通过免疫印迹法测定磷酸-EGFR、磷酸-MAPK和COX-2水平。计算p-MAPK或COX-2表达与总MAPK或β-Actin表达的相对比率。显示了具有代表性的免疫印迹。该图显示了通过密度测定法（三个独立实验的累积结果）测定的蛋白质水平与对照组相比的折合变化，并与每个栏正上方显示的车道相关联。数据是来自两个独立实验的平均值±SE。符号*显示P（P）与BK治疗相比<0.05。（D） B1R-激动剂对p-MAPK和COX-2表达的影响。PCI总线-37A细胞被剥夺血清2天，用不同浓度的B1-促性腺激素Des-Arg处理9-p-MAPK（左侧面板）BK 10分钟，COX-2（右侧面板）2小时。所使用的方法与图4 A-C中所述的方法相同。这是一个具有代表性的实验，重复了两次，结果类似。
图4
图4。BK诱导的EGFR、MAPK磷酸化和COX-2表达是通过B2缓激肽受体介导的，而不是B1缓激肽接收器介导的
（A） BK受体拮抗剂存在时BK诱导EGFR磷酸化。（B） BK受体拮抗剂存在时BK诱导MAPK磷酸化。（C） BK受体拮抗剂存在时BK诱导COX-2表达。PCI-37A细胞被剥夺血清3天，用一系列浓度的B1受体拮抗剂Lys-（Des-Arg9-卢8)-BK或B2受体拮抗剂HOE140处理1小时，然后用50nM BK处理5分钟以检测磷酸化EGFR和磷酸化MAPK，用10nM BK处理2小时以测量COX-2。制备全细胞裂解物，并使用材料和方法中描述的特定抗体通过免疫印迹法测定磷酸-EGFR、磷酸-MAPK和COX-2水平。计算p-MAPK或COX-2表达与总MAPK或β-Actin表达的相对比率。显示了具有代表性的免疫印迹。该图显示了通过密度测定法（三个独立实验的累积结果）确定的与对照相比蛋白质水平的倍数变化，并与每个条正上方显示的泳道相关。数据是来自两个独立实验的平均值±SE。符号*显示P（P）与BK治疗相比<0.05。（D） B1R-激动剂对p-MAPK和COX-2表达的影响。PCI总线-37A细胞被剥夺血清2天，用不同浓度的B1-促性腺激素Des-Arg处理9-p-MAPK（左侧面板）BK 10分钟，COX-2（右侧面板）2小时。所使用的方法与图4 A-C中所述的方法相同。这是一个具有代表性的实验，重复了两次，结果类似。
图4
图4。BK诱导的EGFR、MAPK磷酸化和COX-2表达是通过B2缓激肽受体介导的，而不是B1缓激肽受体介导的
（A） BK受体拮抗剂存在时BK诱导EGFR磷酸化。（B） BK受体拮抗剂存在时BK诱导MAPK磷酸化。（C） BK受体拮抗剂存在时BK诱导COX-2表达。PCI-37A细胞被剥夺血清3天，用一系列浓度的B1受体拮抗剂Lys-（Des-Arg9-卢8)-按照指示使用BK或B2-受体拮抗剂HOE140治疗1小时，然后使用50 nM BK治疗5分钟以检测磷酸-EGFR和磷酸-MAPK，使用10 nM BK治疗2小时以测量COX-2。制备全细胞裂解物，并使用材料和方法中描述的特定抗体通过免疫印迹法测定磷酸-EGFR、磷酸-MAPK和COX-2水平。计算p-MAPK或COX-2表达与总MAPK或β-Actin表达的相对比率。显示了具有代表性的免疫印迹。该图显示了通过密度测定法（三个独立实验的累积结果）测定的蛋白质水平与对照组相比的折合变化，并与每个栏正上方显示的车道相关联。数据是来自两个独立实验的平均值±SE。符号*显示P（P）与BK治疗相比<0.05。（D） B1R-激动剂对p-MAPK和COX-2表达的影响。PCI总线-37A细胞被剥夺血清2天，用不同浓度的B1-促性腺激素Des-Arg处理9-p-MAPK（左侧面板）BK 10分钟，COX-2（右侧面板）2小时。所使用的方法与图4 A-C中所述的方法相同。这是一个具有代表性的实验，重复了两次，结果类似。
图4
图4。BK诱导的EGFR、MAPK磷酸化和COX-2表达是通过B2缓激肽受体介导的，而不是B1缓激肽接收器介导的
（A） BK受体拮抗剂存在时BK诱导EGFR磷酸化。（B） BK受体拮抗剂存在时BK诱导MAPK磷酸化。（C） BK受体拮抗剂存在时BK诱导COX-2表达。将PCI-37A细胞去血清3天，用一定浓度的B1受体拮抗剂Lys-（Des-Arg9-卢8)-按照指示使用BK或B2-受体拮抗剂HOE140治疗1小时，然后使用50 nM BK治疗5分钟以检测磷酸-EGFR和磷酸-MAPK，使用10 nM BK治疗2小时以测量COX-2。制备全细胞裂解物，并使用材料和方法中描述的特定抗体通过免疫印迹法测定磷酸-EGFR、磷酸-MAPK和COX-2水平。计算p-MAPK或COX-2表达与总-MAPK或β-Actin表达的相对比率。显示了具有代表性的免疫印迹。该图显示了通过密度测定法（三个独立实验的累积结果）测定的蛋白质水平与对照组相比的折合变化，并与每个栏正上方显示的车道相关联。数据是来自两个独立实验的平均值±SE。符号*显示P（P）与BK治疗相比<0.05。（D） B1R-激动剂对p-MAPK和COX-2表达的影响。PCI总线-37A细胞被剥夺血清2天，用不同浓度的B1-促性腺激素Des-Arg处理9-p-MAPK（左侧面板）BK 10分钟，COX-2（右侧面板）2小时。所使用的方法与图4 A-C中所述的方法相同。这是一个具有代表性的实验，重复了两次，结果类似。
图5
图5。BK诱导COX-2需要EGFR和MAPK
在随后的治疗中，PCI-37A细胞被剥夺血清3天。（A） 存在EGFR或src抑制剂时BK诱导COX-2表达。用载体、src抑制剂AZD0530（1μM）或EGFR TKI吉非替尼（1μM）预处理细胞60 min，然后用BK（50 nM）处理2 h，并用免疫印迹法分析COX-2蛋白水平。从两个独立的实验中计算COX-2表达与β-肌动蛋白表达的相对比率。（B） 抑制EGFR对BK反应中EGFR磷酸化的影响。细胞与载体、EGFR抗体C225（100nM）或EGFR TKI吉非替尼（1μM）预先孵育5分钟，然后用BK（50 nM）处理10分钟。通过免疫印迹分析代表性自身磷酸化位点Y1068的EGFR磷酸化和总EGFR。计算p-EGFR（PY1068）磷酸化与总-EGFR的相对比率。这是一个具有代表性的实验，重复了两次，结果相似。（C） MEK抑制剂存在时BK诱导COX-2表达。用载体或MEK抑制剂PD 098059（1-50μM）或U0126（1-50µM）预处理细胞1 h，然后用10 nM BK再处理2 h，用COX-2抗体免疫印迹法测定COX-2的表达。显示了具有代表性的免疫印迹。该图显示了通过密度测定法（三个独立实验的累积结果）测定的蛋白质水平与对照组相比的折合变化，并与每个栏正上方显示的车道相关联。所示数据为平均值±SE。符号*表示P（P）与BK治疗相比<0.05。
图5
图5。BK诱导COX-2需要EGFR和MAPK
在随后的治疗中，PCI-37A细胞被剥夺血清3天。（A） 在EGFR或src抑制剂存在下BK诱导COX-2表达。用载体、src抑制剂AZD0530（1μM）或EGFR TKI吉非替尼（1μM）预处理细胞60 min，然后用BK（50 nM）处理2 h，并用免疫印迹法分析COX-2蛋白水平。从两个独立的实验中计算COX-2表达与β-肌动蛋白表达的相对比率。（B） 抑制EGFR对BK反应中EGFR磷酸化的影响。细胞与载体、EGFR抗体C225（100nM）或EGFR TKI吉非替尼（1μM）预先孵育5分钟，然后用BK（50 nM）处理10分钟。通过免疫印迹分析代表性自身磷酸化位点Y1068的EGFR磷酸化和总EGFR。计算p-EGFR（PY1068）磷酸化与总-EGFR的相对比率。这是一个具有代表性的实验，重复了两次，结果相似。（C） BK在MEK抑制剂存在下诱导COX-2表达。用载体或MEK抑制剂PD 098059（1-50μM）或U0126（1-50µM）预处理细胞1 h，然后用10 nM BK再处理2 h，用COX-2抗体免疫印迹法测定COX-2的表达。显示了具有代表性的免疫印迹。该图显示了通过密度测定法（三个独立实验的累积结果）测定的蛋白质水平与对照组相比的折合变化，并与每个栏正上方显示的车道相关联。所示数据为平均值±SE。符号*表示P（P）与BK治疗相比<0.05。
图6
图6。B2受体在头颈癌中过度表达
（A） HNSCC细胞系。对来自永生化正常粘膜细胞系HET1A和三个HNSCC细胞系1483、UM-22B和PCI-37A的细胞裂解物进行免疫印迹分析，以确定B2R水平，然后用β-肌动蛋白重制。（B） 通过免疫印迹比较HNSCC肿瘤与正常粘膜。用免疫印迹法检测6例HNSCC肿瘤和相应对照正常粘膜的裂解液中B2受体水平，并用β-肌动蛋白抗体进行复制。（C） 同一患者肿瘤组织和正常粘膜中B2R表达的免疫组织化学（IHC）。对43例HNSCC患者（三名代表性患者的组织切片）的肿瘤组织和对照正常粘膜进行了B2受体的IHC染色。按照“材料和方法”中的描述对染色强度进行评分，并使用Wilcoxon配对符号秩检验计算p值。
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