Ubiquitin signals autophagic degradation of cytosolic proteins and peroxisomes

doi:10.1073/pnas.0810611105

.2008年12月30日；105(52):20567-74.

doi:10.1073/pnas.081061105。 Epub 2008年12月12日。

泛素信号细胞溶质蛋白和过氧化物酶体的自噬降解

彼得·基俊·金¹, 戴尔·沃伦·海利, 罗伯特·托马斯·马伦, 詹妮弗·利平科特·施瓦茨

附属公司

PMID： 19074260
预防性维修识别码： PMC2602605型
内政部： 10.1073/pnas.081061105

泛素信号细胞溶质蛋白和过氧化物酶体的自噬降解

彼得·基俊·金等。美国国家科学院程序. 2008.

.2008年12月30日；105(52):20567-74.

doi:10.1073/pnas.081061105。 Epub 2008年12月12日。

作者

彼得·基俊·金¹, 戴尔·沃伦·海利, 罗伯特·托马斯·马伦, 詹妮弗·利平科特·施瓦茨

附属

¹美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院国家儿童健康与人类发展研究所细胞生物学和代谢项目，邮编：20892。

PMID： 19074260
预防性维修识别码： PMC2602605型
内政部： 10.1073/pnas.081061105

摘要

自噬负责细胞质成分的非特异性、大量降解。最近的工作还揭示了多泛素化蛋白聚集体的特异性自噬降解，其在神经退行性疾病期间积累。在这里，我们报道了正常长寿的细胞质底物的简单单泛素化足以将这些底物靶向哺乳动物细胞中的自噬降解。也就是说，在它们的泛素化过程中，小的[即红色荧光蛋白（RFP）]和大的（即过氧化物酶体）底物都被有效地靶向自噬体，然后在自噬体-溶酶体融合时在溶酶体内降解。这种靶向性需要泛素结合蛋白p62，并被III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）或自噬相关-12（Atg12）蛋白同源物的缺失所阻断。因此，哺乳动物细胞使用一种涉及泛素和p62的共同途径来靶向不同类型的底物进行自噬。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
泛素将细胞溶质RFP靶向自噬体进行降解。(A类和B类)GFP-LC3和UB-RFP瞬时共转染COS-7细胞(A类)或GFP-LC3和RFP(B类). 转染24小时后对细胞成像。箭头输入(A类)显示共定位GFP-LC3和UB-RFP的明显示例。(C类和D类)GFP-LC3和UB-RFP瞬时共转染COS-7细胞(C类)或GFP-LC3和RFP(D类)在成像前用0.25 mM leupeptin治疗20小时。(E类)COS-7细胞暂时共存GFP-LC3和UB-RFP，在成像前用0.25 mM亮氨酸蛋白酶和10 mM 3-MA处理20 h。(F类)共表达GFP-LC3和UB-RFP的COS-7细胞荧光蛋白酶保护试验。共转染和leupeptin处理24小时后，清洗细胞，然后用0.6%[vol/vol]洋地黄素（D）处理10分钟，然后用0.005%[wt/vol]胰蛋白酶（T）处理，然后进行成像。箭头表示共定位GFP-LC3和UB-RFP的明显示例。（比例尺，10μm）

**图2。**
单体泛素足以通过自噬作用靶向RFP降解。(A类)表达RFP、UB-RFP或UBko-RFP的COS-7细胞裂解物的免疫印迹。用兔抗RFP抗体和驴抗兔IgG结合辣根过氧化物酶，通过SDS/PAGE和免疫印迹法分离25μg总蛋白。星号表示多泛素UBko-RFP的三个较高分子量物种的位置。单箭头表示单一RFP的位置，而双箭头和三箭头分别表示RFP单独和交叉反应带的位置。分子量（kDa）显示在印迹的左侧。(*B–E类*)与LAMP1-GFP和UB-RFP联合转染的COS-7细胞(B类和C类)、UB-RFP(D类)，或RFP(E类). 在成像前20小时添加亮肽（0.25 mM）。中显示的单元格(C类)也用10 mM 3-MA处理。（比例尺，10μm）(F类)量化在GFP-LC3和各种RFP结构共存的细胞中，具有五个或更多点状RFP信号且与GFP-LC2共定位的细胞百分比。细胞也与亮氨酸肽单独（白色条）或亮氨酸肽和3-MA（深灰色条）孵育。所示为三个独立实验的平均值±标准差，每个实验至少包括50个细胞评分。

**图3。**
p62是将UB-RFP螯合到点状结构中所必需的。(A类和B类)用针对p62的siRNA池转染HeLa细胞(A类)或控制siRNA(B类). 20小时后，用相应的siRNA和编码UB-RFP的质粒再次转染细胞。第二次转染后4小时，向细胞中添加leupeptin（0.25 mM），20小时后，固定细胞并用抗p62和Alexa 543山羊抗兔抗体染色。显微照片中显示内源性p62免疫染色的白线框定了UB-RFP共存细胞的轮廓。箭头输入(B类)显示共定位UB-RFP和内源性p62的明显例子。（比例尺，10μm）(C类)量化含有RFP或UB-RFP和GFP-LC3的5个或5个以上点状结构的细胞在转染有对照siRNA或p62 siRNA并用leupeptin处理的细胞中的百分比(A类和B类). 所示为三个独立实验的平均值±标准偏差，每个实验包括至少50个得分的细胞。

**图4。**
PMP的泛素化导致细胞内过氧化物酶体的数量减少。(A类)PMP34-GFP-UBko、UB-GFP-SKL、UBko-PEX3-GFP和PEX3-GFP-UBko的预测拓扑方向示意图。(*B–E类*)COS-7细胞瞬时表达PMP34-GFP(A类)，空向量（模拟）(B类)，PMP34-GFP-UB(C类)，或PMP34-GFP-UBko(D类)转染48小时后，用抗过氧化氢酶和Alexa 543羊抗兔抗体进行固定和染色。注意，两个PMP34-GFP-UBko转化细胞可以在(D类)与空载体转化的细胞相比，这两种载体的过氧化物酶体数量都有所减少(B类)或PMP34-GFP(A类). (F类)表达PMP34-GFP、PMP34-GFP-UB或模拟处理的COS-7细胞裂解物的免疫印迹。对细胞进行裂解，并对25μg总蛋白进行SDS/PAGE，然后用PMP70抗体或细胞溶质蛋白甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH）免疫印迹，作为蛋白质负荷对照。(*G公司*)转染48小时后，每个细胞过氧化物酶体少于50个，表达各种蛋白质的转染细胞总数的百分比。所示为三个独立样本的平均值±标准偏差，每个实验包括至少100个得分的细胞。

**图5。**
自噬途径介导泛素化过氧化物酶体的减少。(A类和B类)COS-7细胞与CFP-LC3和PMP34-Venus共存(A类)或PMP34-Venus-UBko(B类). 箭头输入(B类)显示共定位PMP34-Venus-UBko和CFP-LC3的明显例子。(*C–E类*)共表达LAMP1 Cherry和PMP34-GFP-UBko的COS-7细胞(C类和D类)或PMP34-GFP(E类). 转染后8 h，细胞也用亮氨酸肽（0.25 mM）和氯喹（0.1 mM）处理。中显示的放大率较高的图像(D类)是细胞单层图像放大区域z系列的最大强度投影(C类). (F类)转染24小时或48小时后，每个细胞过氧化物酶体少于50个，表达PMP34-GFP或PMP34-GFP-UB，并且有或没有3-MA的转染细胞总数的百分比。所示为三个独立样本的平均值±标准偏差，每个实验包括至少100个细胞得分。（比例尺，10μm）

**图6。**
沉默Atg12表达可防止泛素介导的过氧化物酶体降解。(A类)Atg12 siRNA治疗前（第0天）或Atg12 siRNA治疗后1天和2天HeLa细胞裂解物的免疫印迹。对细胞进行裂解，并对25μg总蛋白进行SDS/PAGE，然后用Atg12或GAPDH抗体进行免疫印迹，作为负荷对照。Atg12-Atg5蛋白结合物减少表明Atg12表达减少。(*B–C类*)用针对Atg12的siRNA池转染HeLa细胞(B类)或非靶向控制siRNA(C类). 首次转染后的24小时，用适当的siRNA和编码PMP34-GFP-UBko的质粒再次转染细胞。第二次转染细胞48小时后固定，并用抗Atg12和Alexa 543山羊抗兔抗体染色。(D类)每个细胞过氧化物酶体少于50个，表达PMP34-GFP或PMP34-GFP-UBko，并用对照siRNA或Atg12 siRNA处理的细胞总数的百分比。所示为三个独立样本的平均值±标准偏差，每个实验包括至少100个细胞得分。（比例尺，10μm）

**图7。**
p62是过氧化物酶体降解所必需的。(A类和B类)HeLa细胞瞬时表达PMP34-GFP-UBko(A类)或PMP34-GFP(B类)转染48小时后，用抗p62和Alexa 543羊抗兔抗体进行固定和染色。箭头输入(A类)显示共定位PMP34-GFP-UBko和内源性p62的明显例子。中合并图像中列出的单元格区域(B类)插图中放大倍率较高；注意到在该细胞中表达的PMP34-GFP和内源性p62缺乏任何明显的共定位。(*C–F类*)如图所示，用控制siRNA或p62（p62 siRNA）的siRNA池转染HeLa细胞。首次转染后24小时，用siRNA和编码PMP34-GFP-UBko的质粒再次感染细胞(C类和D类)或PMP34-GFP(E类和F类). 细胞在首次转染处理48小时后固定并染色。显示的所有图像都是z系列的最大投影。(*G公司*)在转染后72小时用对照siRNA或p62 siRNA处理的具有少于50个表达PMP34-GFP或PMP34-GFP UBko的过氧化物酶体的转染细胞总数的百分比。所示为三个独立样本的平均值±标准偏差，每个实验包括至少75个得分的细胞。(*H（H）*)用控制siRNA或p62的siRNA池处理的至少25个细胞的免疫标记内源性过氧化氢酶的平均荧光强度。还显示了平均值的标准偏差(*P（P）*< 0.01). （比例尺，10μm）

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