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.2008年12月9日；105(49):19211-6.
doi:10.1073/pnas.0810452105。 Epub 2008年12月2日。

Barkor作为Beclin 1和III类磷脂酰肌醇3-激酶的哺乳动物自噬特异性因子的鉴定

孙启明 1, 微凉扇, 陈可玲（Keling Chen）, 丁晓军, She Chen女士, 清忠
附属公司

Barkor作为Beclin 1和III类磷脂酰肌醇3-激酶的哺乳动物自噬特异性因子的鉴定

孙启明等。 美国国家科学院程序. .

摘要

自噬介导细胞对人类营养剥夺、蛋白质聚集和病原体入侵的反应。自噬功能异常与包括癌症在内的多种人类疾病有关。哺乳动物细胞中新的自噬因子的鉴定将为这一复杂的细胞途径如何应对广泛的挑战提供关键的机制性见解。在这里，我们报道了通过与人磷脂酰肌醇3-激酶III类复合物中的Beclin 1直接相互作用，克隆了一种我们称为Barkor（Beclin 1-associated autophagy-related key regulator）的自噬特异性蛋白。Barkor与酵母Atg14具有18%的序列同源性和32%的序列相似性。通过RNA干扰消除Barkor表达会破坏饥饿和雷帕霉素诱导的LC3脂质氧化和自噬体形成。Barkor的过度表达导致自噬激活，自噬体数量增加，体积增大。很明显，Barkor也是抑制哺乳动物细胞中鼠伤寒沙门氏菌自噬介导的细胞内存活所必需的。从机制上讲，Barkor与抗紫外线辐射相关基因产物（UVRAG）竞争与Beclin 1的相互作用，Barkor-Beclin1的复合形成是它们定位于自噬体所必需的。因此，我们定义了一种由Barkor介导的调节信号通路，该通路通过Beclin 1积极控制自噬，并代表了治疗与自噬功能障碍相关的人类疾病的药物开发的潜在靶点。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
Barkor是Beclin 1–PI3KC3复合体的主要组成部分。(A类)串联亲和纯化Beclin 1复合物或载体在U中的银染2OS细胞。所有标记条带均经质谱鉴定。(B)从人肾胚胎HEK293T细胞中纯化出类似的Beclin 1复合物。(C)Barkor和Beclin 1的相互共免疫沉淀。用抗Barkor或Beclin 1抗体免疫沉淀293T细胞提取物，然后进行分析。(天)Beclin 1为PI3KC3和Barkor之间的相互作用架起了桥梁。用FLAG-PI3KC3和Myc-Barkor转染Beclin 1-敲低293T细胞或对照细胞。用抗FLAG或Myc抗体免疫沉淀全细胞裂解物并进行分析。(E类)Barkor基因敲除降低体内PI3KC3的活性。Barkor-击倒U2用FYVE2-EGFP表达载体转染OS细胞。转染30小时后，用5 mM 3-MA处理细胞4小时。FYVE2-EGFP在F类.
图2。
图2。
Barkor是LC3脂质化和自噬体形成所必需的。(A类)在Beclin 1和Barkor-knowdown U中检测LC3结合2全培养基（DMEM+10%FBS）或饥饿培养基（厄尔平衡盐溶液，EBSS）中的OS细胞。(B)用500 nM雷帕霉素处理Barkor敲除细胞过夜，检测LC3结合。蛋白酶抑制剂（2μg/mL E64D和2μg/mL胃蛋白酶抑制素4小时）用于阻断溶酶体降解。(C–E类). Barkor敲除细胞的电子显微镜（EM）分析。两个控制单元(C)和Barkor敲除细胞(天)在EBSS中饥饿1h，并进行透射电镜分析。(E类)中框架区域的高清晰度图片C显示包含细胞内内容物的AV（用箭头标记）。[比例尺：2μM(C)，2微米(天)和1μM(E类).] (F类)每个横截面细胞的AVs（平均值±SD；n个=21）在EM下进行计算和总结。CM，全介质。箭头表示自噬液泡。(G–I型)Barkor-overpression（OE）U公司2OS细胞(H（H）和我)和U2OS亲代细胞(G公司)在EM下观察到(我)中框架区域的高清晰度图片H（H）显示包含细胞内内容物的AV（用箭头标记）。[比例尺：1μM(G–I型).] (J型)计算EM下每个横截面细胞的AVs。(K（K）)计算并总结Barkor OE细胞或正常细胞AVs的平均大小。(L（左）)用Barkor（野生型或CCD缺失突变体）或UVRAG转染HEK293T细胞，并在这些细胞中检测LC3结合。
图3。
图3。
Barkor在体内对细菌复制的自噬介导抑制中不可或缺。(A类)附件7+/+ 和附件7−/−MEF细胞被野生型GFP标记物感染鼠伤寒沙门氏菌（SL1344）（绿色）8小时，并通过免疫染色进行分析。用抗微管蛋白抗体（红色）对细胞进行复染。(B)附件7+/+或附件7−/−MEF感染了鼠伤寒沙门氏菌（SL1344）。感染细胞用硫酸庆大霉素处理以阻止细胞外细菌扩增，然后溶解，并将内化细菌涂布在培养皿上。通过计算培养皿上的菌落数来量化细菌的复制。(C)Barkor-击倒U2强力霉素诱导OS细胞2天并感染鼠伤寒沙门氏菌如中所述A类. (天)Barkor-knowdown U中的细菌生长2按照中所述测量OS细胞B.
图4。
图4。
Barkor和UVRAG通过其CCD与Beclin 1形成不同的亚复合物。(A类)Barkor通过CCD与Beclin 1结合。用FLAG-Beclin 1、Myc-Barker或其Myc-tagged突变体转染293T细胞。全细胞裂解物（WCL）用抗Myc免疫沉淀（IP），然后用抗FLAG免疫印迹（IB）。§表示非特定带。(B)Beclin 1通过其CCD与Barkor结合。用Myc-Barker、FLAG-Beclin 1或其FLAG标记突变体转染293T细胞。用抗FLAG免疫沉淀WCL，然后用抗Myc免疫沉淀IB。(C)Beclin 1与Barkor或UVRAG直接相互作用。Ni-column首先与His-Beclin 1-CC孵育，然后与FLAG标记的Beclin 1-CC、Barkor-CC和UVRAG-CC孵育。分析与珠子和输入物结合的蛋白质。(天)Barkor和UVRAG与Beclin 1形成不同的亚复合物。用FLAG-UVRAG、Myc-Barker和HA-Beclin 1转染293T细胞。用抗FLAG、抗HA或Myc对WCL进行免疫沉淀，并对免疫沉淀进行分析。(E类)Barkor与UVRAG竞争与Beclin 1的结合。UVRAG首次与Beclin 1在体外孵育；然后将增加剂量的Barkor CCD添加到反应中。在大量洗涤后，用考马斯蓝染色的SDS/PAGE分析与珠结合的蛋白质。(F类)UVRAG与体内Barkor–Beclin 1相互作用竞争。将HA-Beclin 1与Myc-Barkor或FLAG标记的UVRAG共转染到HEK293T细胞中。用抗HA免疫沉淀WCL，然后用抗Myc、FLAG或HA抗体免疫沉淀IB。
图5。
图5。
Barkor通过直接相互作用促进Beclin 1易位到自噬体。(A类)Barkor的亚细胞定位。转染U中检测到荧光Barkor-EGFP2模拟治疗后的OS细胞(我)，500 nM雷帕霉素(二)，EBSS介质(三)，或分别在荧光显微镜下的EBSS和5mM 3-MA。(B)每个细胞Barkor-EGFP点的量化。(C)Barkor-EGFP点状染色阳性细胞的定量。(天)Barkor和LC3的Colocalization。A U型2表达Myc-LC3的OS稳定细胞系转染Barkor-EGFP，然后模拟处理(I–III级)或用500 nM雷帕霉素处理(四至九)持续12小时(I–VI类)GFP-Barkor（绿色）与Myc-LC3（红色）共染。(七至九)GFP-Barkor（绿色）与内源性EEA1（红色）（内体标记）共染色。(E类)U型2用RFP-Beclin 1转染OS细胞。(I–III级)RFP-Beclin 1与内源性TGN38（绿色）（a）共染色反式-高尔基网络标记）。(IV–VI类)U型2将Barkor-EGFP（绿色）和RFP-Beclin 1（红色）转染OS细胞，观察Barkor-EGFP（红色）和RFP-Beclin 2（红色）的荧光。(七至九)U型2用RFP-Beclin 1、Myc-Barker和GFP-LC3转染OS细胞，观察GFP-LC2（绿色）和RFP-Bellin 1（红色）的荧光。(X–XII号)，U2用RFP-Beclin 1和Barkor CCD缺失突变体融合的EGFP转染OS细胞，并观察到GFP-Barkor CCD缺失（绿色）和RFP-Beclin 1（红色）的荧光。
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