AIP1 functions as an endogenous inhibitor of VEGFR2-mediated signaling and inflammatory angiogenesis in mice

doi:10.1172/JCI36168

.2008年12月；118(12):3904-16.

doi:10.11172/JCI36168。 Epub 2008年11月3日。

AIP1作为VEGFR2介导的信号传导和炎症血管生成的内源性抑制剂在小鼠中发挥作用

张海峰¹, 云和, 盛传代, 徐哲（Zhe Xu）, 阎罗, 汀湾, 罗殿红, 丹尼斯·琼斯, 石波堂, 洪晨（音）, 威廉·塞萨, 王敏

附属公司

PMID： 19033661
预防性维修识别码：项目经理2575835
内政部： 10.1172/JCI36168

AIP1作为VEGFR2介导的信号传导和炎症血管生成的内源性抑制剂在小鼠中发挥作用

张海峰等。临床研究杂志. 2008年12月.

.2008年12月；118(12):3904-16.

doi:10.1172/JCI36168。 Epub 2008年11月3日。

作者

张海峰¹, 云和, 盛传代, 徐哲（Zhe Xu）, 阎罗, 汀湾, 罗殿红, 丹尼斯·琼斯, 石波堂, 洪晨（音）, 威廉·塞萨, 王敏

附属

¹美国康涅狄格州纽黑文市耶鲁大学医学院病理学系血管生物学和治疗学跨部门项目，邮编06520。

PMID： 19033661
预防性维修识别码：项目经理2575835
内政部： 10.1172/JCI36168

摘要

ASK1相互作用蛋白-1（AIP1）是最近发现的Ras-GTP酶激活蛋白家族的一个成员，在血管内皮细胞中高度表达，并在体外调节内皮细胞凋亡。然而，其体内功能尚未确定。为了研究这一点，我们培育了AIP1缺陷小鼠（KO小鼠）。尽管这些小鼠在血管发育方面没有明显缺陷，但在2种炎症性血管生成模型中，它们的血管生成显著增强。在其中一个模型中，在KO小鼠中观察到的血管生成增强与VEGF-VEGFR2信号传导增加有关。与此一致，VEGF诱导的KO小鼠耳、角膜和视网膜新生血管显著增加，而AIP1的过度表达显著减少了增强的视网膜新生血管。在体外，AIP1的过度表达抑制了VEGF诱导的EC迁移，而AIP1敲除和敲除都增强了EC迁移，AIP1-敲除引起的EC迁移增强与VEGFR2信号增加有关。我们提供的机制数据表明，在VEGF应答的后期，AIP1被招募到VEGFR2-PI3K复合物中，与VEGFR2和PI3K p85结合，这导致VEGFR2信号的抑制。总之，我们的数据表明AIP1在VEGFR2介导的小鼠适应性血管生成中作为内源性抑制剂发挥作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。AIP1-flox和敲除小鼠的产生。**
(A类)产生AIP1 flox小鼠的策略示意图。靶向载体包含5′臂第3/4外显子、靶向区域第5/6外显子和3′臂第7外显子。PCR引物P1–P6如图所示。带有的5′探头*Hin公司*dIII消化，3′探针*Sca公司*我的消化是指。(B和C)ES克隆的筛选。从阳性克隆中提取基因组DNA并用于Southern blot后面的III摘要(B)和3′探头*Sca公司*我消化了(C). 克隆51呈阳性，用于胚泡注射以产生嵌合体小鼠。(D类)的生成*AIP1（AIP1）^+/液氧*和*AIP1（AIP1）^+l–*老鼠。嵌合体与C57BL/6交配进行种系传递，获得AIP1^+/液氧.AIP1型^+/液氧小鼠进一步与β-actin Cre小鼠交配，以删除靶向区域（外显子5/6）和尼奥基因(*AIP1基因^+/–*老鼠）。KO小鼠是通过杂合子之间的交配获得的(*AIP1（AIP1）^+/——*)男性和女性。(E类和F类)组织中AIP1缺失。将WT和KO小鼠的肌肉和主动脉匀浆，用抗AIP1抗体的Western blot检测AIP1的表达(E类). 用抗AIP1抗体免疫组化法检测肌肉和主动脉石蜡切片中AIP1的表达(F类). 对于肌肉组织，箭头表示毛细血管，箭头表示大血管。对于主动脉组织，箭头表示内皮，箭头表示平滑肌层。

**图2。KO小鼠体内动脉生成和血管生成增强。**
(A类)与WT小鼠相比，KO小鼠的肢体灌注恢复增强。在术前和术后30分钟、3天、2周和4周分别测量缺血和非缺血肢体的胃肠肌血流量。数据（平均值±SEM）表示为非缺血腿与缺血腿的灌注单位比率**P（P）<*0.05. (B和C)KO小鼠动脉生成增强的血管造影证据。缺血4周后WT和KO小鼠的动脉期血管造影(B)通过定量血管造影确定(C). 数据是2张血管造影的平均值**P（P）<*0.05. (D类——F类)KO小鼠血管生成增强。用CD31（EC标记物）对毛细血管密度和周细胞募集进行免疫染色。缺血后第28天WT和KO小鼠非缺血组和缺血组的代表性切片如所示D类毛细管密度的量化（数量/mm²肌肉面积）和CD31/肌细胞比率如所示E类和F类.数据为每节10个字段的平均值±SEM（3节/只小鼠；n个=每个应变为4）**P（P）<*0.05.

**图3。KO小鼠在海绵肉芽肿模型中显示血管生成增强。**
将聚乙烯醇海绵植入WT和KO小鼠皮下。海绵在第21天收获并进行三色染色(A类)巨噬细胞浸润（F4/80）和血管形成（抗CD31）的免疫染色(C). (B)红细胞的数量(D类)F4/80阳性细胞，以及(E类)定量CD31-阳性毛细血管。数据为每节10个字段的平均值±SEM（3节/小鼠和n个对于每个菌株＝5）**P（P）<*0.05. (F类)KO中增强的VEGF-VEGFR2信号。采集海绵的液体和细胞。用Western blot和抗血管内皮生长因子（VEGF）检测液体中的VEGF。用Western blot分别用抗磷酸化VEGFFR2（pY1054/59）和抗VEGFR2测定细胞裂解液中的磷酸化和总VEGFR2蛋白。还测定了AIP1和β-微管蛋白。HPF，大功率场。

**图4。在KO小鼠中，VEGF诱导的视网膜和角膜新生血管显著增强。**
(A类和B)VEGF诱导的视网膜血管生成。向WT和KO小鼠静脉注射Ad-VEGF或Ad-LacZ。通过isolectin染色显示视网膜血管A类，血管密度量化B. (C和D类)VEGF诱导的角膜血管生成试验。将含有VEGF的Hydron颗粒植入WT和KO小鼠的角膜。植入后第5天通过立体显微镜评估血管生成(C)血管密度在D类数据是每个组织（耳朵、视网膜或角膜）10个字段的平均值±SEM(n个=每组5）**P（P）<*0.05. Ad-LacZ，编码*LacZ公司*β-gal表达基因；Ad-VEGF，编码*血管内皮生长因子*VEGF表达基因。

**图5。AIP1过表达抑制了VEGF诱导的EC迁移和管形成，但AIP1缺失使其增强。**
(A类——D类)AIP1过度表达抑制EC迁移。HUVEC在4μm多西环素存在下感染表达WT的腺病毒（Ad-AIP1）24小时。(A类)用抗AIP1蛋白免疫印迹法检测AIP1的表达。(B)细胞在无血清培养基中培养过夜，并进行跨孔迁移分析(C量化D类)单层“伤口损伤”测定对VEGF（10ng/ml）的反应。(E类和F类)AIP1过度表达抑制EC管的形成。HUVEC感染Ad-AIP1并接受Matrigel试管形成试验VEGF（10 ng/ml）(E类量化F类). (**G公司**——J型)AIP1缺乏增加了EC的迁移和管的形成。将WT和KO小鼠肺微血管内皮细胞（MLEC）在0.5%FBS中培养过夜，并进行如上所述的EC迁移和管形成。(**G公司**)用抗AIP1蛋白免疫印迹法检测AIP1的表达。跨阱分析中EC迁移的定量(**H（H）**)，“伤口损伤”分析(我)和试管形成分析(J型)如图所示。给出的数据是来自3个独立实验的三重数据的平均值±SEM**P（P）*< 0.05.

**图6。AIP1通过在VEGF反应的晚期与VEGFR2的活性形式结合来抑制VEGFR2依赖性信号传导。**
(A类)将WT和KO小鼠肺微血管内皮细胞在0.5%FBS中培养过夜，然后进行VEGF治疗（10 ng/ml），持续0-30分钟，如图所示。用相应抗体通过Western blot检测VEGFR2、PLC-γ和Akt的磷酸化以及总蛋白。(B)VEGFR2-PI3K-AIP1复合物的形成。如图所示，用VEGF治疗HUVEC 0–30分钟。用相应抗体通过Western blot检测输入物中p-VEGFR2、总VEGFR2，PLC-γ和AIP1的蛋白。用抗VEGFR2免疫沉淀法测定内源性VEGFR2与AIP1、PLC-γ和PI3K p85的相关性，然后分别用抗AIP1，抗PLC-β和PI3K p85进行Western blot。(C和D类)抑制剂对VEGFR2-PI3K-AIP1复合物形成的影响。将HUVEC的血清饥饿16小时，并用以下抑制剂进行预处理：U73122（U22）、U73343（U43）、SU1498（SU）或LY294002（LY）（每种抑制剂在10μM浓度下处理30分钟C; LY294002和沃特曼（麦芽汁）在1μM下放置30分钟D类.–，模仿。用VEGF（10 ng/ml）刺激细胞15分钟，用相应抗体通过Western blot测定输入物中的p-VEGFR2、总VEGFR2，PLC-γ和AIP1蛋白。内源性VEGFR2与AIP1和PI3K p85的相关性如上所述。

**图7。AIP1通过其PR基序与PI3K的SH3结构域结合，而AIP1则通过C2结构域与VEGFR2的酪氨酸磷酸化形式结合。**
(A类)AIP1结构域和表达式构造的示意图。PH表示PH域。C2，PKC保守域，其中K1和K2表示2个赖氨酸簇；PER，类周期结构域；LZ，亮氨酸拉链图案；ΔPR，删除PR；N、 AIP1-N；C、 AIP1-C；C-PR，AIP1在C端含有PR基序。(B)体外GST下拉测定。使用来自293T表达裂解物的AIP1-C-PR和AIP1-C-ΔPR，使用包含PI3K p85、α-精蛋白（Spect）和Src激酶SH3结构域的GST融合蛋白进行下拉分析。结合AIP1-C-PR和AIP1-C-ΔPR用抗FLAG的Western blot检测。考马斯蓝染色显示GST-SH3融合蛋白。(C和D类)将各种AIP1构建体（F，AIP1-F；N，AIP1-N；C，AIP1-C）与VEGFR2共表达，并通过用抗VEGFR2进行免疫沉淀，然后用抗FLAG进行蛋白质印迹来确定AIP1-VEGFR2的结合。(E类)赖氨酸簇在AIP1 C2结构域中起着关键作用。将AIP1-N或其C2域突变体（KA1-3）在VEGFR2存在下转染至293T。AIP1-VEGFR2相关性如上所述确定。

**图8。AIP1负调控VEGFR2的机制。**
(A类和B)AIP1突变体对VEGFR2介导的信号传导的影响。VEGFR2-WT或激酶活性突变体（KM）与各种AIP1突变体（AIP1-N、AIP1-C-PR和PHC2）共转染A类以及AIP1-N和AIP1-N-R289L[RL]B)变成293T细胞。通过各自的抗体测定磷酸VEGFR2（pY1054/1059）和总VEGFR2、PLC-γ和Akt。显示了p-VEGFR2/VEGFR2、p-PLC-γ/PLC-γ和p-Akt/Akt的相对比值，未处理的WT为1.0。用免疫印迹法检测AIP1突变体的表达。注意，2个FLAG印迹在同一凝胶上进行，但不连续，如黑线所示。用抗VEGFR2免疫沉淀法检测AIP1与各种VEGFR2的相关性，然后用抗FLAG免疫印迹法检测AIP2与多种VEGFR2之间的相关性。(C)AIP1作为VEGFR2介导信号传导中的内源性调节因子的模型。VEGF快速诱导VEGFR2二聚化和自磷酸化，随后PLC-γ和PI3K的募集和激活，导致PLC-β-ERK、PI3K/Akt的激活和血管生成。AIP1被招募到VEGFR2-PI3K复合体中以响应VEGF反应。AIP1通过其C2结构域与VEGFR2结合，而通过其PR结构域与PI3K p85的SH3结构域结合，关闭VEGFR2激活，导致正常血管生成。在缺乏AIP1的情况下，VEGFR2介导的血管生成反应增强。

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