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.2009年1月9日；284（2）：1302-12。
doi:10.1074/jbc。M804796200。 Epub 2008年11月10日。

蛋白激酶C-delta双C1a和C1b结构域的差异作用表征

永美铺 1, 苏珊·加菲尔德, 诺埃米·凯迪, 彼得·布隆伯格
附属公司

蛋白激酶C-delta双C1a和C1b结构域的差异作用表征

永美铺等。 生物化学杂志. .

摘要

经典和新型蛋白激酶C（PKC）同工酶包含两个锌指基序，分别命名为“C1a”和“C1b”结构域，它们构成第二信使二酰甘油（DAG）或佛波酯的识别模块。然而，这些串联C1结构域对PKC功能的个别贡献以及蛋白质上下文对其功能的影响仍然不确定。在本研究中，我们准备了PKCdelta结构，其中删除、交换或替换单个C1a和C1b域以探索这些问题。作为分离片段，δC1a和δC1b结构域都能有效结合佛波酯，但δC1a结构域与[（3）H]佛波酯12,13-二丁酸酯（[（3。在完整的PKCdelta中，deltaC1b结构域在[（3）H]PDBu结合、膜移位和下调中起主导作用。尽管如此，δC1a结构域的贡献是明显的，如亲和力降低时保留[（3）H]PDBu结合，在表达第二个δC1a域取代δC1b结构域时增加[（3，但其贡献小于从孤立结构域的活性预测的。将δC1b结构域的位置转换为δC1a结构域的正常位置（反之亦然）对佛波酯的反应没有明显影响，这表明C1结构域在PKCdelta中的特定位置不是其活性的主要决定因素。

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数字

图1。
图1。
完整PKC C1突变体的结构δ. 野生型PKCδ在C端与GFP融合。单个δC1a或δC1b包含突变体（删除其中一个C1结构域）位置开关C1突变体（交换δC1a的位置和δC1b结构域），以及双δC1a或δC1b突变体（用一个C1结构域替换另一个）按所述制备在“材料和方法”下
图2。
图2。
PKC C1a和C1b结构域的分离鉴定δ在体外.一个，的序列比较δC1a和δC1b域。B类和C类、Scatchard图第页，共页[三H] PDBu与纯化和分离的δC1a和δC1b域。GST标记了δC1a和δC1b随着[三H] PDBu公司在18°C下，在100μg/ml PS存在下保持10分钟使用聚乙二醇沉淀分析进行测量，如下所述“材料和方法。”点数代表平均值±一次代表性测定中三次测定的S.E实验。另外两个实验给出了类似的结果。这个Kd日表示为平均值±S.E(n个= 3独立实验）。D类和E类，的依赖项[三H] PDBu与GST标记的δC1a和δC1b结合分析中磷脂组成的结构域。在这些分析中，而不是分析中的100μg/ml PSB类和C类，的该分析含有100μg/ml总磷脂，包括以下混合物PS:PC，其中指示了PS:PC混合物中PS的重量%的值。的特定绑定[三H] PDBu（2-5个米)到C1不同PS:PC比例（0，5，10，20，25，50，75、90和100%PS）测量并绘制为每次测定中的最大结合。这个酒吧在每个图中表示三个独立实验的平均值。误差线,±S。E.公司。
图3。
图3。
GFP标记的C1a的移位(一个)和C1b(B类)PKC域δ作为对活LNCaP细胞中PMA的反应时间的函数。表达GFP标记的C1a或C1b结构域的细胞用1μ米项目管理局。荧光的重新分布用蔡司MRC1024共焦显微镜监测蛋白质的功能添加PMA后的时间。每15或30秒拍摄一次图像面板代表三个独立的典型示例实验。
图4。
图4。
野生型PKC的易位δ-GFP和单个C1活性LNCaP细胞中对PMA反应的结构域突变体。表达用PMA处理GFP标记的野生型或突变型PKCδ。这个用蔡司MRC1024监测荧光蛋白的重新分布共焦显微镜作为添加PMA后时间的函数。图像每30秒就被抓获一次。一个，野生型的时间序列图像添加1μ后的PKCδ-GFP米项目管理局。B类，时间PKCδ-GFP的单个δC1b突变体的序列图像（带有δC1a域删除）添加1μ米PMA中。C类，单个δC1a突变体的时间序列图像添加10后PKCδ-GFP（删除δC1b域）μ米项目管理局。每个面板表示来自三个独立的实验。
图5。
图5。
PKC位置转换C1突变体的易位δ对活LNCaP细胞中的PMA作出反应。表达用PMA处理PKCδ-GFP的位置开关C1突变体。这个用蔡司MRC1024监测荧光蛋白的重新分布共焦显微镜作为添加PMA后时间的函数。图像每30秒就被抓获一次。一个，位置切换的时间序列图像单个δC1b突变体（δC1b位于正常位置δC1a）添加1μ米项目管理局。B类，时间位置开关单个δC1a突变体（带有δC1a）的系列图像δC1b的正常位置）μ米项目管理局。每个面板表示来自三个独立的实验。野生型PKCδ-GFP的对照（未显示数据）与图4一个.
图6。
图6。
单链C1a突变体和双链C1a突变的易位PKC公司δ-活LNCaP细胞中GFP转PMA。表达单个δC1a（只有一个δC1a结构域）和双δC1a用PMA处理PKCδ-GFP（含两个δC1a结构域）突变体。用蔡司MRC监测荧光蛋白的重新分布添加PMA后，1024共焦显微镜随时间变化。每30秒拍摄一次图像。一个，单个的时间序列图像添加10μ后的δC1a突变体米项目管理局。B类,添加10后双δC1a突变体的时间序列图像μ米项目管理局。每个面板代表的典型示例三个独立的实验。
图7。
图7。
野生型下调的蛋白质印迹分析PKC公司δ-GFP及其单、双C1a和C1b突变体NIH3T3细胞对PMA的反应。野生型过度表达细胞PKCδ-GFP，以及单个和双C1突变体与增加浓度（0 n米，10牛顿米, 100n个米, 1 μ米, 3 μ米、和10μ米)然后收集细胞，用RIPA缓冲液，并进行Western印迹。对于每个构造，相等在对照组和处理过的样品中加入一定量的蛋白质。一个，结果来自一个具有代表性的单一实验。每个实验进行了四到五次，结果相似。B类,作为PMA功能的蛋白质水平变化的量化浓度。对胶片进行扫描，相对带强度为使用ImageJ确定。未经处理的谱带强度为标准化为1。每个柱在中图表代表四到五次实验的平均值。统计显著性（与每组中对照样本的值）t吨测试：*,第页<0.05；**,第页< 0.01; 和***,第页< 0.001.
图8。
图8。
体外野生型PKC的激酶分析δ-GFP公司还有单打和双打δC1a和δC1b突变体。野生型PKCδ-GFP和C1突变体在CHO-K1细胞中表达，用于24小时，表达水平相似。使用用抗GFP抗体免疫沉淀，然后等量在30°C下与不同浓度的PDBu孵育30分钟。这个在体外用Promega蛋白激酶测定激酶活性C符合制造商协议的检测试剂盒。激酶活性如中所示图表相对于基础活性进行计算野生型PKCδ-GFP。一个，比较在里面体外野生型PKCδ-GFP和单核蛋白激酶活性δC1a和δC1b突变体与PDBu浓度和PKC抑制剂GF109203X对小鼠脑组织基底激酶活性的影响构造。B类，比较在体外激酶活性野生型PKCδ-GFP和双δC1a和δC1b突变体作为PDBu浓度和PKC抑制剂作用的函数GF109203X对构建物的基础激酶活性的影响。这个酒吧在里面每个图表表示三个独立变量的平均值实验。误差线，±S。E.统计显著性（与每组对照样本的值进行比较）t吨测试：*,第页<0.05；**,第页< 0.01; 和***,第页< 0.001.
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