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.2008年12月19日；283(51):35517-25.
doi:10.1074/jbc。M805019200。 Epub 2008年10月30日。

微管抑制剂诱导Bcl-xL主要磷酸化位点的鉴定及其功能意义分析

Meenakshi Upreti公司 1, 埃琳娜·加利托夫斯卡娅, 朱荣, 艾伦·J·塔克特, 大卫·T·特拉诺, 苏珊娜·格拉内尔, 蒂莫西·钱伯斯
附属公司

微管抑制剂诱导Bcl-xL主要磷酸化位点的鉴定及其功能意义分析

Meenakshi Upreti公司等。 生物化学杂志. .

摘要

长春碱和其他微管抑制剂用作抗有丝分裂癌药物，其特点是促进关键抗凋亡蛋白Bcl-xL的磷酸化。然而，已经根据JNK的潜在识别推断出磷酸化的推测位点，并且还没有进行直接的生化分析。在本研究中，我们使用蛋白质纯化和质谱鉴定Ser-62是体内的一个主要位点。定点突变证实Ser-62是被测试的几种微管抑制剂诱导的Bcl-xL磷酸化位点。与表达野生型Bcl-xL的细胞相比，过度表达Ser-62-->Ala突变体的长春花碱处理细胞的凋亡率显著降低。共免疫沉淀显示，磷酸化导致野生型Bcl-xL释放结合Bax，而磷酸化缺陷型Bcl-xL保留结合Bax的能力。相反，磷酸化（Ser-62-->Asp）Bcl-xL结合Bax的能力降低。通过在不同Bcl-xL突变体的背景下瞬时共转染Bax进行功能测试。野生型或磷缺陷型Bcl-xL的共表达抵消了Bax表达对细胞活力的不利影响，而磷缺陷型的Bcl-xL未能提供相同水平的Bax保护。这些研究表明，微管抑制剂诱导的Bcl-xL磷酸化至少部分通过抑制Bcl-xL结合Bax的能力发挥关键的促凋亡作用。

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数字

图1。
图1。
HA Bcl-xL的过度表达和亚细胞分布。 A类，未转染（–）或两个HA Bcl-xL克隆的提取物稳定转染细胞系（+）用Bcl-xL进行免疫印迹或HA抗体。GAPDH被用作负荷控制。分子质量指示了标准。B类KB-3和KB-3/HA-Bcl-xL细胞未经处理或用30n处理米或200牛顿米长春碱（VBL）。细胞质和线粒体制备组分并进行Bcl-xL免疫印迹。原发酶3和Cox II（复合物IV）的免疫印迹被用作标记细胞溶质和线粒体亚细胞组分。C，细胞溶质提取物，如面板B，检测活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3。
图2。
图2。
HA-Bcl-xL过表达细胞对长春碱具有耐药性。 A类、KB-3或KB-3/HA-Bcl-xL细胞接受MTT细胞活性用指示浓度的长春碱处理72天后的测定h.所示结果为平均值±S.D(n个= 6).B类,KB-3或KB-3/HA-Bcl-xL细胞未经处理或用VBL处理（30n个米，48 h），并进行如下所述的凋亡检测“实验程序”年轴表示405nm处的吸光度。所示结果为平均值±S.D(n个=6).
图3。
图3。
Bcl-xL的免疫纯化。KB-3细胞未经处理(车道1和2)或用200 n处理米24小时VBL(车道3和4). 使用8 mg蛋白质的免疫沉淀与执行(+Ab，车道2和4）或不带（-抗体，车道1和3）Bcl-xL抗体。免疫沉淀物在（15厘米分离凝胶）13.5%丙烯酰胺凝胶，胶体染色考马斯蓝。未磷酸化和磷酸化的HA-Bcl-xL带为所示为从IgG珠衍生的IgG轻链和重链。
图4。
图4。
主要磷酸化位点的鉴定。 A、，HA-Bcl-xL型用胰蛋白酶在凝胶中消化或单独用内蛋白酶AspN消化生产用于MALDI质谱分析的肽，以识别肽大胆的代表64%Bcl-xL序列覆盖率。HA标记和垫片，Ser-62为下划线的。B类，MALDI质量天冬氨酸-N修饰的HA-Bcl-xL突显肽61-75的光谱未经处理和长春花碱处理的细胞显示单一磷酸化（质量长春碱处理样品中添加80 Da），但未检测到在未经处理的对照组中观察到磷酸化。肽61–75在两个样品中均显示Asn-66完全脱酰胺（质量添加1 Da）。C，从未经处理的KB-3细胞制备全细胞提取物（控制(反对的论点))或用30n处理16小时的细胞米VBL、，和等分样品（5μg）在磷酸化条件下与或孵育不含FL62，一种含有长春碱诱导磷酸化的肽现场，Ser-62，如“实验程序”所述样品采用高分辨率16.5%丙烯酰胺Tris/Tricine肽进行分析凝胶（31）。磷光图像暴露48小时后获得，显示磷酸化FL62。
图5。
图5。
特异性突变后Bcl-xL磷酸化缺陷第62列。 A类，KB-3细胞系表达等量的野生型(重量)或HA-Bcl-xL（S62A）未经治疗或用200n个米长春碱24小时，并对提取物进行Bcl-xL免疫印迹未磷酸化和磷酸化(对)指示的表格。GAPDH免疫印迹作为负荷控制。B类，KB-3电池表达野生型或HA-Bcl-xL（S62A）的品系未经处理或用200牛顿米长春碱24h，提取物免疫沉淀使用Bcl-xL抗体并进行磷丝氨酸免疫印迹(p-丝氨酸)或Bcl-xL，如图所示。请注意，磷丝氨酸只是免疫沉淀WT Bcl-xL或Bcl-xL（T47A）后观察长春碱治疗。车道3、8和11代表在没有初级抗体的情况下进行沉淀。免疫印迹法IgG作为附加对照。C，KB-3细胞系表达野生型或HA-Bcl-xL（S62A）的人未经治疗或用200n个米紫杉醇(税务)VBL或长春新碱(录像机)24小时，并用磷酸化形式进行Bcl-xL的免疫印迹被起诉的(对).
图6。
图6。
Bcl-xL的Ser-62到Ala突变使细胞对长春花碱诱导细胞凋亡。 A类，细胞表达野生型HA-Bcl-xL或两个克隆表达S62A突变体或一个克隆表达T47A突变株未经处理或用长春碱处理（200 n米, 48h） ，并使用如下所述的细胞死亡酶联免疫吸附试验“实验程序”年轴表示405nm处的吸光度。结果表示平均值±S.D(n个=6）和是两个独立实验的代表。*，明显地与表达WT-Bcl-xL的细胞不同(第页< 0.001).B类,表达野生型HA-Bcl-xL或S62A突变体的细胞未经处理或长春碱处理（200 n米)36小时，细胞提取物制备并进行聚ADP-核糖聚合酶免疫印迹(PARP项目). 此外，还检测了Bcl-xL和GAPDH的表达表明。C，表达野生型HA-Bcl-xL或S62A突变体的细胞未经处理或长春花碱处理（200 n米)36小时，电池制备提取物并进行6A7活性免疫沉淀Bax抗体和Bax免疫印迹。不存在时制备的沉淀物作为对照，分析6A7抗体。D类，全细胞提取物免疫印迹法检测Bax的总表达，并重新绘制GAPDH以确认等负荷。
图7。
图7。
磷酸化影响Bcl-xL/Bax相互作用。表达野生型Bcl-xL或Bcl-xL（S62A）未经治疗或用VBL（200n个米36 h），Bcl-xL被免疫沉淀。免疫沉淀与执行(车道2、3、6、和7)或不带(车道4和8)Bcl-xL抗体。全细胞提取物也进行了分析(车道1和5). 样品分析由Bax免疫印迹(顶部面板)，密件抄送(中间面板),和IgG(下部面板).
图8。
图8。
磷缺陷型和磷微量Bcl-xL的功能研究突变体。 A类，KB-3细胞瞬时转染pCDNA3.1或与HA-Bcl-xL、磷缺陷Bcl-xL（S/A）或磷胺Bcl-xL（S/D）突变体结构。转染后48小时制备提取物Bcl-xL和GAPDH的免疫印迹。B类，的相位对比图像以10倍放大率转染相应质粒的KB-3细胞去除非粘附细胞后。C，KB-3细胞与pCDNA 3.1或HA-Bcl-xL、磷酸化缺陷型Bcl-xL（S/A）联合转染，或磷酸模拟Bcl-xL（S/D）突变体构建体和Myc-pCMV或Myc-Bax。在转染后48小时收集转染细胞Bcl-xL、Bax、HA标签、Myc标签或GAPDH的免疫印迹。D类，阶段质粒共转染48h后贴壁细胞的对比图像表明。E类、每个细胞的粘附细胞和非粘附细胞联合转染分别收集、计数并表示为占单元格总数的百分比。数据表示六个变量的平均值独立测定结果差异小于5%。F类,使用Bcl-xL抗体和来自48小时后进行上述联合转染Bcl-xL或Bax的免疫印迹。IgG免疫印迹作为控件。E、 细胞提取物。
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