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.2008年12月19日；283(51):35517-25.
doi:10.1074/jbc。M805019200。 Epub 2008年10月30日。

微管抑制剂诱导Bcl-xL主要磷酸化位点的鉴定及其功能意义分析

Meenakshi Upreti公司1, 埃琳娜·加利托夫斯卡娅, 朱荣, 艾伦·J·塔克特, 大卫·T·特拉诺, 苏珊娜·格拉内尔, 蒂莫西·钱伯斯
附属公司

微管抑制剂诱导Bcl-xL主要磷酸化位点的鉴定及其功能意义分析

Meenakshi Upreti公司等。 生物化学杂志. .

摘要

长春碱和其他微管抑制剂用作抗有丝分裂癌药物，其特点是促进关键抗凋亡蛋白Bcl-xL的磷酸化。然而，已经根据JNK的潜在识别推断出磷酸化的推测位点，并且还没有进行直接的生化分析。在本研究中，我们使用蛋白质纯化和质谱鉴定Ser-62是体内的一个主要位点。定点突变证实Ser-62是被测试的几种微管抑制剂诱导的Bcl-xL磷酸化位点。与表达野生型Bcl-xL的细胞相比，过度表达Ser-62-->Ala突变体的长春花碱处理细胞的凋亡率显著降低。共免疫沉淀显示，磷酸化导致野生型Bcl-xL释放结合Bax，而磷酸化缺陷型Bcl-xL保留结合Bax的能力。相反，磷酸化（Ser-62-->Asp）Bcl-xL结合Bax的能力降低。通过在不同Bcl-xL突变体的背景下瞬时共转染Bax进行功能测试。野生型或磷缺陷型Bcl-xL的共表达抵消了Bax表达对细胞活力的不利影响，而磷缺陷型的Bcl-xL未能提供相同水平的Bax保护。这些研究表明，微管抑制剂诱导的Bcl-xL磷酸化至少部分通过抑制Bcl-xL结合Bax的能力发挥关键的促凋亡作用。

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数字

图1。
图1。
HA-Bcl-xL的过度表达和亚细胞分布。 A类，来自未转染（-）或两个HA-Bcl-xL克隆的提取物稳定转染细胞系（+）用Bcl-xL进行免疫印迹或HA抗体。GAPDH被用作负荷控制。分子质量指示了标准。B类KB-3和KB-3/HA-Bcl-xL细胞未经处理或用30n处理米或200牛顿米长春碱（VBL）。细胞质和线粒体制备组分并进行Bcl-xL免疫印迹。使用procaspase 3和Cox II（复合物IV）的免疫印迹作为标记物细胞溶质和线粒体亚细胞组分。C类，细胞溶质提取物，如面板B，检测活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3。
图2。
图2。
HA-Bcl-xL过表达细胞对长春碱具有耐药性。 A类、KB-3或KB-3/HA-Bcl-xL细胞接受MTT细胞活性用指示浓度的长春碱处理72天后的测定h.所示结果为平均值±S.D(n个= 6).B类,KB-3或KB-3/HA-Bcl-xL细胞未经处理或用VBL处理（30n个米，48 h），并进行如下所述的凋亡检测“实验程序”年轴表示405nm处的吸光度。所示结果为平均值±S.D(n个=6).
图3。
图3。
Bcl-xL的免疫纯化。KB-3细胞未经处理(车道1和2)或用200 n处理米24小时VBL(车道3和4).使用8 mg蛋白质的免疫沉淀与执行(+Ab，车道2和4）或不带（-抗体，车道1和3）Bcl-xL抗体。免疫沉淀物在（15厘米分离凝胶）13.5%丙烯酰胺凝胶，胶体染色考马斯蓝。未磷酸化和磷酸化的HA-Bcl-xL带为所示为从IgG珠衍生的IgG轻链和重链。
图4。
图4。
主要磷酸化位点的鉴定。 A、，HA-Bcl-xL型用胰蛋白酶在凝胶中消化或单独用内蛋白酶AspN消化生产用于MALDI质谱分析的肽，以识别肽大胆的代表64%Bcl-xL序列覆盖率。HA标记和垫片，Ser-62为下划线的。B类，MALDI质量天冬氨酸-N修饰的HA-Bcl-xL突显肽61-75的光谱未经处理和长春花碱处理的细胞显示单一磷酸化（质量长春碱处理样品中添加80 Da），但未检测到在未处理的对照中观察到磷酸化。肽61–75在两个样品中均显示Asn-66完全脱酰胺（质量添加1 Da）。C类，从未经处理的KB-3细胞制备全细胞提取物（控制(反对的论点))或用30 n处理16 h的细胞米VBL、，和等分样品（5μg）在磷酸化条件下与或孵育不含FL62，一种含有长春碱诱导磷酸化的肽现场，Ser-62，如“实验程序”所述样品采用高分辨率16.5%丙烯酰胺Tris/Tricine肽进行分析凝胶（31）。磷光图像暴露48小时后获得，显示磷酸化FL62。
图5。
图5。
特异性突变后Bcl-xL磷酸化缺陷第62列。 A类，KB-3细胞系表达等量的野生型(重量)或HA-Bcl-xL（S62A）未经治疗或用200n个米长春花碱24小时，并对提取物进行Bcl-xL免疫印迹未磷酸化和磷酸化(P（P）)指示的表格。GAPDH免疫印迹作为负荷控制。B类，KB-3电池表达野生型或HA-Bcl-xL（S62A）的品系未经处理或用200牛顿米长春碱24h，提取物免疫沉淀使用Bcl-xL抗体并进行磷丝氨酸免疫印迹(p-丝氨酸)或Bcl-xL，如图所示。请注意，磷丝氨酸只是在WT Bcl-xL或Bcl-xL（T47A）免疫沉淀后观察到长春碱治疗。车道3、8和11代表在没有初级抗体的情况下进行沉淀。免疫印迹法IgG作为附加对照。C类，KB-3细胞系表达野生型或HA-Bcl-xL（S62A）的人未经治疗或用200n个米紫杉醇(税务)VBL或长春新碱(录像机)24小时，并对Bcl-xL进行免疫印迹，以磷酸化形式被起诉的(P（P）).
图6。
图6。
Bcl-xL的Ser-62到Ala突变使细胞对长春花碱诱导细胞凋亡。 A类，细胞表达野生型HA-Bcl-xL或两个克隆表达S62A突变体或一个克隆表达T47A突变株未经处理或用长春碱处理（200 n米, 48h） ，并使用a定量评估细胞凋亡的相对程度如下所述的细胞死亡酶联免疫吸附试验“实验程序”年轴表示405nm处的吸光度。结果表示平均值±S.D(n个=6）和是两个独立实验的代表。*，显著与表达WT-Bcl-xL的细胞不同(第页< 0.001).B类,表达野生型HA-Bcl-xL或S62A突变体的细胞未经处理或长春碱处理（200 n米)36小时，细胞提取物制备并进行聚ADP-核糖聚合酶免疫印迹(PARP项目).此外，还检测了Bcl-xL和GAPDH的表达表明。C类，表达野生型HA-Bcl-xL或S62A突变体的细胞未经处理或长春花碱处理（200 n米)36小时，电池制备提取物并进行6A7活性免疫沉淀Bax抗体和Bax免疫印迹。不存在时制备的沉淀物作为对照，分析6A7抗体。D类，全细胞提取物免疫印迹法检测Bax的总表达，并重新绘制GAPDH以确认等负荷。
图7。
图7。
磷酸化影响Bcl-xL/Bax相互作用。表达野生型Bcl-xL或Bcl-xL（S62A）未经治疗或用VBL（200n个米36 h），Bcl-xL被免疫沉淀。免疫沉淀与执行(车道2、3、6、和7)或不带(车道4和8)Bcl-xL抗体。全细胞提取物也进行了分析(车道1和5).样品分析方法Bax免疫印迹(顶部面板)，Bcl-xL(中间面板),和IgG(下部面板).
图8。
图8。
磷缺陷型和磷微量Bcl-xL的功能研究突变体。 A类，KB-3细胞瞬时转染pCDNA3.1或与HA-Bcl-xL、磷缺陷Bcl-xL（S/A）或磷胺Bcl-xL（S/D）突变体结构。转染后48小时制备提取物Bcl-xL和GAPDH的免疫印迹。B类，的相位对比图像以10倍放大率转染相应质粒的KB-3细胞去除非粘附细胞后。C类，KB-3细胞与pCDNA 3.1或HA-Bcl-xL、磷酸化缺陷型Bcl-xL（S/A）联合转染，或磷酸化Bcl-xL（S/D）突变体构建物和Myc-pCMV或Myc-Bax。在转染后48小时收集转染细胞Bcl-xL、Bax、HA标签、Myc标签或GAPDH的免疫印迹。D类，阶段质粒共转染48h后贴壁细胞的对比图像表明。E类、每个细胞的粘附细胞和非粘附细胞分别收集共转染，计数并表达为占单元格总数的百分比。数据表示六个变量的平均值独立测定结果差异小于5%。F类,使用Bcl-xL抗体和来自48小时后进行上述联合转染Bcl-xL或Bax的免疫印迹。IgG免疫印迹作为控件。E，细胞提取物。
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