RanBP2 and SENP3 function in a mitotic SUMO2/3 conjugation-deconjugation cycle on Borealin

doi:10.1091/mbc.e08-05-0511

.2009年1月；20(1):410-8.

doi:10.1091/mbc.e08-05-0511。 Epub 2008年10月22日。

Borealin上有丝分裂SUMO2/3结合-去结合循环中的RanBP2和SENP3功能

Ulf R Klein公司¹, 马库斯·海因德尔, 埃里希·A·尼格, 斯特凡·慕勒

附属公司

PMID： 18946085
预防性维修识别码： PMC2613119型
内政部： 10.1091/mbc.e08-05-0511

RanBP2和SENP3在博乐林有丝分裂SUMO2/3结合-去结合循环中的作用

Ulf R Klein公司等。分子生物学细胞. 2009年1月.

.2009年1月；20(1):410-8.

doi:10.1091/mbc.e08-05-0511。 Epub 2008年10月22日。

作者

Ulf R Klein公司¹, 马库斯·海德尔, 埃里希·A·尼格, 斯特凡·慕勒

附属

¹德国马丁斯里德马克斯·普朗克生物化学研究所细胞生物学系。

PMID： 18946085
预防性维修识别码： PMC2613119型
内政部： 10.1091/mbc.e08-05-0511

摘要

泛素样SUMO系统控制细胞的关键功能，几条证据表明SUMO在有丝分裂进程中起着关键作用。然而，在哺乳动物细胞中，有丝分裂的sumoylation底物和所涉及的调控成分尚不明确。在这里，我们将染色体乘客复合物（CPC）的一种成分Borealin确定为SUMO的有丝分裂靶点。CPC还包括INCENP、Survivin和Aurora B，调节关键的有丝分裂事件，包括染色体聚集、纺锤体组装检查点和胞质分裂。我们表明，博莱林优先被SUMO2/3修饰，并且证明这种修饰在有丝分裂过程中是动态调节的，在早期有丝分裂中达到峰值。有趣的是，SUMO连接酶RanBP2与CPC相互作用，在体外刺激SUMO修饰Borealin，并且是其体内修饰所必需的。此外，SUMO异肽酶SENP3是Borealin的一种特殊的相互作用伙伴，催化从Boeralin中去除SUMO2/3。因此，这些数据描绘了Borealin的有丝分裂SUMO2/3结合-去结合循环，并进一步指定了RanBP2和SENP3在有丝分裂SUMO途径中的调节功能。

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数字

**图1。**
Borealin与SUMO系统的成分相互作用，并在体外被SUMO修饰。（A和B）博莱林与Ubc9的相互作用（A）以及SUMO1和SUMO2的共轭形式（B，顶部两行），但不包括不共轭形式（SUMO^{通用航空公司})（B，底部两行）LW表示板块缺乏亮氨酸和色氨酸，而QDO表示板块缺乏亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤。（C和D）Borealin在体外被SUMO修饰。³⁵通过体外转录/翻译产生的S-标记的CPC亚基与重组E1、E2以及SUMO1（C）或SUMO2（D）在ATP存在下孵育。在对照反应中，省略了E1酶。SUMO–Borealin共轭物用箭头表示。

**图2。**
Borealin在体内被SUMO修饰，并优先被SUMO2/3靶向。（A）分别在COS-7细胞中同时表达Myc-tagged Borealin和HA或His-tagged版本的SUMO1或SUMO2。在Ni-NTA珠上回收他的SUMO缀合物，并通过使用抗-myc抗体进行蛋白质印迹。（B）按照A.（C）Myc-tagged Borealin和任一野生型（SUMO1^重量、SUMO2^重量)或His-tagged SUMO形式（SUMO1）的突变版本^K16R系列、SUMO2^K11R系列)在COS-7细胞中共表达，并按A所述进行分析。（D）Borealin被内源性SUMO2/3修饰，但不是SUMO1。通过紫杉醇治疗，在前中期将表达His-tagged Borealin的HeLa细胞阻滞16 h。在Ni-NTA珠上回收His-Boeralin，并使用抗Borealin1、抗SUMO2/3或抗泛素抗体进行免疫印迹。约45 kDa（星号）下的Borelin反应带被解释为Borelin–SUMO2/3降解产物。（E）内源性Borealin与SUMO2/3结合。用来自紫杉醇阻滞的HeLa细胞的抗SUMO2/3或对照IgG进行免疫沉淀，并用所示抗体通过Western印迹进行探测。

**图3。**
Borealin的Sumoylation受细胞周期调节，需要RanBP2。（A） Borealin的Sumoylation受细胞周期调控。表达His-Borealin的HeLa细胞在G1期（1区）、中期（2区）或晚期（3区和4区）被阻止。用抗Borealin和抗SUMO2/3抗体（5-8道）通过Western blotting检测His-Borealins和His-Boeralin-conjugates。标有星号的条带被解释为Borealin–SUMO2/3降解产物。通过监测细胞周期蛋白B1水平来分析有丝分裂状态。（B） RanBP2与CPC绑定。用兔抗Borealin抗体或来自紫杉醇抑制的HeLa细胞的免疫前血清进行免疫沉淀，并用所示抗体进行Western blotting检测。抗PIAS2抗体针对α和β亚型。星号表示抗PIAS2交叉反应带。（C） RanBP2在体外刺激Borealin的琥珀酰化。³⁵通过体外转录/翻译产生的S-标记的Borealin或p53，在限制E2浓度下进行体外sumoylation试验。跑步BP2^ΔFG以500 ng（3号车道）、50 ng（4号车道）和5 ng（5号车道）的浓度添加。SUMO共轭物用箭头表示。（D） RanBP2是Borealin在体内酰化所必需的。用针对指示蛋白的siRNA寡核苷酸处理的HeLa细胞中，Myc-tagged Borealin和His-SUMO2共存。消耗通过Western blotting进行验证。针对PIAS2的siRNA靶向α和β亚型（Yang等。, 2005). 抗PIAS2蛋白印迹中的星号表示交叉反应带。在Ni-NTA珠上回收His–SUMO2结合物，并用抗myc抗体进行Western印迹。

**图4。**
跑步BP2^ΔFG在缺失RanBP2的细胞中恢复Borealin的sumoylation。（A）用针对RanBP2或GL2的siRNA寡核苷酸处理的HeLa细胞中，FLAG标记的Borealin和His-SUMO2共存。同时，用空的myc载体（−）、myc标记的野生型RanBP2转染细胞^ΔFG（wt）或催化活性RanBP2^ΔFG（AA）携带突变L2651A和L2653A。RanBP2耗竭和myc-tagged RanBP2的表达^ΔFG构建物经Western blotting验证。在Ni-NTA珠上回收His-SUMO2结合物，并用抗FLAG抗体进行Western blotting检测Borealin-SUMO结合物。（B–E）RanBP2过度表达^ΔFG在有丝分裂期间导致染色体错误分离。（B）未经转染的有丝分裂对照细胞被Borealin抗体染色。（C）用myc标记的RanBP2转染HeLa细胞^ΔFG并用myc-和Borealin抗体染色。注意后期发病后大量染色体错位。（D）实验如C.Bottom，myc-和tubulin抗体共染。（E）实验如C中所示，但催化活性的RanBP2^ΔFG构造（RanBP2^{ΔFG AA})被转染。DNA用4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。棒材，10μm。（F）不同细胞周期阶段的RanBP2蛋白水平。将HeLa细胞从双胸苷块释放到诺卡唑中，在诺卡唑释放后的不同时间点制备裂解物，并用抗RanBP2抗体进行检测。通过监测细胞周期蛋白B1水平来测定有丝分裂状态。微管蛋白水平可作为负荷控制。as.=异步生长细胞。（G）采用定量RT-PCR测定同步化HeLa细胞中RanBP2和Borealin mRNA在细胞周期进展中的水平。

**图5。**
CPC在着丝粒和中心纺锤体上的组装和定位与Borealin sumoylation无关。（A） RanBP2不影响CPC在动粒/着丝粒区域的定位，反之亦然。用指示的siRNA双工体处理HeLa细胞48小时，并对RanBP2和Borealin进行染色。DNA用DAPI染色。棒材，10μm。（B）用对博乐林3′非翻译区特异的siRNA双链体处理HeLa细胞，同时用博乐林HA或博乐林HA转染^25公里用针对HA、磷酸化（S7）-CENP-A和PRC1的抗体进行免疫荧光。DNA用DAPI染色。棒材，10μm。（C） HeLa细胞转染指定的结构体，通过胸腺嘧啶核苷处理被阻滞在S期，然后释放10小时进入有丝分裂。制备有丝分裂裂解物，用抗HA抗体进行免疫沉淀，并用所示抗体进行免疫印迹。星号表示免疫球蛋白重链。

**图6。**
SENP3与Borealin共定位并相互作用。（A） FLAG标记的SENP3和myc标记的Borealin结构在HeLa细胞中共存。使用抗myc抗体进行免疫沉淀。由于等电点不同，博莱林的两个片段表现出不同的电泳迁移率。星号表示免疫球蛋白。（B） SENP3和Borealin在间期核仁中共定位。用FLAG-SENP3和HA-Borealin转染HeLa细胞。通过抗HA和抗FLAG抗体的免疫染色确定定位。（C）有丝分裂过程中SENP3的定位。用FLAG标记的SENP3转染HeLa细胞并孵育48小时。用抗FLAG和抗Borealin抗体进行免疫染色。SENP3在有丝分裂期间定位于细胞质，从分裂前期到分裂后期，SENP3与Borealin部分重叠。（C′）在末期，SENP3在重整核膜处聚集，在胞质分裂期间重新进入核仁。DNA用DAPI染色。棒材，10μm。

**图7。**
SENP3催化博莱林的去甲酰化。（A）野生型SENP3（SENP3）的FLAG标记版本^重量，车道3和8）和SENP5（SENP5^重量，通道5和10），或催化失活突变体（SENP3^C532S型、4、9车道和SENP5^C713S公司将体外翻译/转录产生的通道6和11）添加到体外磺酰化的博莱林中。抗FLAG蛋白印迹作为蛋白酶的负载控制。注意，当与SENP3孵育时，博莱林的SUMO2/3（而非SUMO1）解共轭^重量但不是SENP3^C532S型（B）Myc-tagged Borealin和His-SUMO构建物与FLAG-tagged SENP3共表达^重量（车道2、5、8和11）或SENP3^C532S型（3、6、9和12车道）。His-SUMO结合物在Ni-NTA珠上回收（7-12道），并用抗myc抗体进行Western印迹。通过抗FLAG Western blotting验证SENP3结构的表达。（C和C′）SENP3缺失导致SUMO2/3修饰的Borealin积累。用His-tagged Borealin转染HeLa细胞，显示siRNA双链，经胸苷处理后阻滞在S期，释放10 h后进入有丝分裂。制备有丝分裂裂解物并如上所述进行Ni-NTA沉淀。用指示的抗体进行免疫印迹，以证明相应蛋白（C′）的耗竭，并监测博莱林（C）的磺酰化状态。约45 kDa（C中的星号）下的Borelin反应带被解释为Borelin–SUMO2/3降解产物。请注意，与对照缺失细胞相比，SENP3（而非SENP5）的敲低增强了Borealin sumoylation。相反，RanBP2敲除会导致Borealin修饰缺失。

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