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审查
。2008年10月；88(4):1277-340.
doi:10.1152/physrev.00027.2007。

脑细胞外间隙扩散

伊娃·西科娃 1, 查尔斯·尼科尔森
附属公司
审查

脑细胞外间隙扩散

伊娃·西科娃等。 生理学评论。 2008年10月。

摘要

脑细胞外空间（ECS）的扩散受体积分数和曲折度的限制，修正的扩散方程代表了大脑中许多分子的传输行为。与方程式的偏差揭示了分子通过细胞吸收、结合或其他机制穿过血脑屏障的损失。早期扩散测量使用放射性标记的蔗糖和其他示踪剂。目前，实时离子电渗（RTI）方法用于小离子，集成光学成像（IOI）方法用于荧光大分子，包括葡聚糖或蛋白质。ECS的理论模型和模拟研究了ECS几何形状、死区微域效应、细胞外基质以及大分子与ECS通道的相互作用的影响。在正常脑组织中使用阳离子四甲基铵（TMA）的RTI方法进行的广泛实验研究表明，ECS的体积分数通常约为20%，曲折度约为1.6（即TMA的自由扩散系数减少了2.6），尽管存在区域差异。这些参数在发育和老化过程中发生变化。扩散特性在一些干预措施中得到了表征，包括大脑刺激、渗透挑战和细胞外基质成分的敲除。在缺血期间、阿尔茨海默病和帕金森病模型以及人类胶质瘤中也进行了测量。总的来说，这些研究改进了我们对ECS结构以及胶质细胞和细胞外基质在调节ECS微环境中的作用的概念。ECS扩散特性的知识在从理解突触外体积传递到开发药物传递到大脑的范式等方面都很有价值。

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数字

图1
图1
ECS的基本概念。答：。带有树突棘和突触的大鼠皮层小区域的电子显微镜。ECS的轮廓为红色；它有一个连接良好的泡沫状结构，由简单的凸面细胞表面的间隙形成。尽管由于固定程序，ECS的宽度可能会减小，但很明显，ECS宽度并不完全均匀。校准棒约1μm。（修改自参考文献264）。B类1-B类4。执行随机行走的分子揭示了结构。B类1：通过理想的2D方形大脑区域的横截面，该区域以不透水的墙壁为边界，包含许多圆形细胞轮廓。ECS宽度过大。B类2:三个分子（不同颜色）从B中标有红色“+”的位置释放出来1允许执行多达150个随机步骤。如果分子遇到细胞边界或细胞壁，则取消该步骤并选择下一个随机步骤。在此和随后的两个面板中省略了单元的轮廓，只显示了随机行走的轨迹。B中的三条轨迹2似乎有随机分布。B类3:12个分子执行随机行走，现在它们的轨迹集合开始显示细胞的存在。B类4:48次随机行走揭示了细胞边界和区域边界的越来越精确的视图。请注意，此模拟中的各个步骤都很大，以减少显示几何体所需的数量（修改自参考文献264）。C、。影响ECS中分子扩散的因素。这些是：a）ECS的几何形状，与自由介质相比，它对扩散分子施加了额外的延迟。b） 死空间微域，分子在探索死引擎时会浪费时间。如图所示，这种微结构域可能以“口袋”的形式存在，但也可能以胶质包裹的形式存在或甚至以ECS局部扩大的形式存在。c） 以细胞外基质分子（如透明质酸）形式出现的阻塞。d） 扩散分子在细胞膜或细胞外基质上的结合位点。e）固定负电荷，也位于细胞外基质，可能影响带电分子的扩散。
图2
图2
ECS的理论模型。一个1-A类2.'单位单元格'。复制和堆叠这些基本对象可以构建一个简单的ECS（点画区域）。一个1显示了八个立方体单元在中心的交点一个2显示了单元之间的2D管状通道系统。（修改自参考文献218）。B。ECS构造为二维非对称网格，用于计算机扩散解的有限元方法（修改自参考文献61）。C、。用蒙特卡罗方法模拟小间距三维立方单元封装，形成ECS。一组分子（红色）被释放在整体的中心，正在进行随机行走，导致分子云向外扩散并探索当地环境。（Hrabe和Hrabětová，未出版）。D。截短的八面体单元的集合。这些也填充了3D空间，但与立方体的集合不同，立方体在细胞阵列中没有对齐的通道。（修改自参考380）。E类1-E类2。假设神经胶质细胞包裹在神经元周围，形成一个死空间微结构域。E类1图中显示了单个神经元-胶质细胞组合，虚线表示一个分子可能走的两条路径。胶质包裹物内的路径明显较长，与避免进入包裹物的路径相比，扩散分子的延迟时间更长。E类2显示了一组包裹的神经元。（Hrabětová，未出版）。F类1-F类2。用于分析大分子扩散的ECS孔隙模型。F类1.一个管状孔，其中分子（黄色）具有流体动力直径d日H（H）占据了相当数量的孔，在分子周围留下少量ECS（蓝色）。此处，总ECS被设想为一组连接管（c.f.面板a2)可能在细胞外基质内形成。F类2.平面孔或片状孔。在这里，分子有更多的横向移动自由度（参见图A1). （修改自参考文献391）。
图3
图3
放射性示踪法。答：。示踪剂通过右侧脑室（RLV）灌注并扩散至大脑3-5小时，然后固定并移除大脑。如图所示切割大脑小块，并进行放射性检测。该数字表示给定组织块中放射性标记的菊粉或蔗糖的百分比。尾状核（CN）紧邻RLV，因此对该结构进行了最彻底的分析。2毫米的比例尺适用于狗的大脑。（修改自参考303）。B。C的浓度14-蔗糖和H3-犬脑室胸骨灌注4小时后的菊粉。纵坐标绘制在互补误差函数（erfc）标度上（见方程式12），C类x个是远处的浓度x个（横坐标）从尾状核心室边缘的浓度C类0（修改自参考104）。C、。分子从脑室CSF进入脑组织后可能遵循的几种途径示意图。箭头表示路径；箭头的粗细代表了该路径的相对重要性。蔗糖和菊糖主要是胞外的，甘露醇在一定程度上进入细胞，少量穿过BBB，水很容易进入细胞并穿过BBB。（修改自参考104）。
图4
图4
RTI方法。答：。原始设置。将成对的离子导入和离子选择微电极（ISM）粘在一起并放入大鼠小脑体内离子电导微电极通过由恒流电路控制的电流脉冲。来自ISM的离子传感和参考桶的信号被阻抗缓冲并相减，以去除大脑中局部电位的贡献。这导致输出与局部离子浓度的对数成正比。将电极阵列放入琼脂中进行控制测量。（修改自参考257）。B。使用四种不同离子的RTI记录示例。所有记录均在大鼠小脑中记录体内。每组中的每个记录都是在源电极和ISM之间的不同间距处进行的。纵坐标是浓度，横坐标是时间。有关详细信息，请参阅原始文件。（修改自参考257）。C、。蜥蜴小脑前部的一部分。这个小脑与乌龟的小脑非常相似。一个，分子层；B类，浦肯野细胞；C类，颗粒层；D类室管膜（修改自参考文献56）。D。由海龟小脑和对照介质中测量的平均扩散参数导出的理论浓度-时间曲线证明了扩散各向异性。理论记录说明了TMA离子导入过程中达到的相对浓度+在中x个-,年-和z（z）-分子层、颗粒层（GrL）和琼脂凝胶的轴。用于计算曲线的扩散距离为120μm。曲折度值为：分子层，λx个= 1.44,λ年= 1.95,λz（z）= 1.58,α=0.31和颗粒层，λ= 1.77,α= 0.22. （修改自参考文献314）。E.公司。用于测量大鼠胼胝体各向异性的装置体内采用RTI-TMA方法。该设计与面板A所示类似，只是使用了两个离子电渗微电极，以允许在x个-和年-或x个-和z（z）-轴（修改自参考410）。F、。RTI-TMA方法测量大鼠胼胝体的示例。在这个记录中，λx个=1.44，λ年= 1.70,λz（z）= 1.72,α= 0.24. 坐标为TMA+浓度，横坐标是时间。（修改自参考文献358）。
图5
图5
答：。脑切片中集成光学成像（IOI）方法和RTI-TMA的设置。将脑片或稀释的琼脂糖（或琼脂）凝胶放入装有外荧光光学元件的复合显微镜载物台上的小室中。对于IOI，荧光分子是从微量吸管中压力注入的，并且是使用电荷耦合器件（CCD）相机拍摄的时间序列图像。用PC处理图像，使方程20与沿选定图像轴测得的强度分布相吻合。扩散系数，D类和D类*分别在琼脂糖凝胶和脑片中提取。如图所示，RTI-TMA测量也可以在此设置中进行，其优点是离子电泳微电极和ISM可以在视觉控制下独立定位。IOI和RTI测量可以同时进行。（修改自参考文献149）。B类1-B类270kDa荧光葡聚糖的扩散曲线。B类1在琼脂糖凝胶中压力注射20、40、60、80、120和160秒后测量轮廓，作为物体空间（切片）距离的函数。轮廓具有高斯曲线的特征形状。B类2在大鼠皮层切片中测量的类似轮廓。请注意，由于切片的扭曲，大脑中的轮廓折叠比琼脂糖慢得多(λ=2.25（对于70 kDa右旋糖酐）。（修改自参考文献265）。C类1-C类266kDa荧光牛血清白蛋白（BSA）的扩散曲线。C类1.在琼脂糖凝胶中压力注射后4、8、12、16、24和32秒测量的轮廓，作为物体空间（切片）距离的函数。C类2在大鼠皮层切片中测量的类似轮廓。压力注入后20、40、60、80、120和160秒测得的轮廓；同样，大脑中的轮廓折叠比琼脂糖慢得多(λ=2.26（对于66 kDa BSA）。（修改自参考文献379）。
图6
图6
IOI测量体内使用3kDa葡聚糖和量子点。答：。IOI扩散测量的实验装置体内用冷却电荷耦合器件（CCD）相机和带10×水浸物镜的外荧光显微镜（见图5A），在微移液管向稀释琼脂糖或体感皮层压力喷射后，拍摄荧光探针扩散的连续图像，通过大鼠打开的颅骨窗口进入（比例尺–500μm）。B。右旋糖酐在新皮层的扩散。荧光dex3喷射到琼脂糖或皮层后的典型图像。下图所示图像的荧光强度分布和理论拟合，得出D类= 2.3 × 10−6厘米2秒−1和D类* = 4.5 × 10−7厘米2秒−1比例尺–200μm。C、。量子点示意图（QD655，Invitrogen）。内核镉和硒提供特征荧光。核用锌壳稳定，锌壳又具有有机涂层，有机涂层上附着有许多PEG分子，使量子点可溶于水。QD655的最终直径为35 nm。D。新皮质中的量子点扩散。QD655喷射到琼脂糖或皮层后的典型图像。比例尺–100μm。荧光强度曲线和理论拟合如下图所示，得出D类= 1.9 × 10−7厘米2秒−1和D类* = 1.6 × 10−9厘米2秒−1插图中皮层数据的线性回归（见方程20）；γ我2=4D类∗(吨我+吨0)，所以回归γ我2∕4在上面吨我返回的斜率为D类*. （面板A、B和D修改自参考391）。
图7
图7
开发期间扩散参数的变化。答：。三维条形图描述了出生后天数和皮质层中体积分数随年龄的分布。第二层和第三层太小，无法在一些早期进行测量。B。出生后不同天皮质IV、V、VI层和皮质下白质（WM）理论扩散曲线的比较。使用方程式13和方程式15以及扩散参数的平均值计算每条曲线α,λ,k个‘Lehmenkühler等人（193）给出（也总结在表4A、4B中）。计算离子电渗微电极和ISM之间的间距曲线第页=175μm，值为D类=1.26×10−5厘米2秒−1和n个吨使用=0.5。注意，振幅最低的曲线出现在最早的年龄段，这主要是因为当时体积分数较大。（面板A和B修改自参考193）。
图8
图8
渗透挑战对大鼠皮层切片扩散曲线的影响。答：。挑战150摩尔千克−1ACSF公司。305摩尔千克中四个控制扩散记录的序列−1培养基，然后是四分之一150摩尔千克−1恢复到305 mosmole kg后，达到中等水平，最后又增加了四个记录−1中等。记录之间的间隔比所示的间隔更长，以使基线浓度稳定。对于A组中的所有记录，第页=106微米，n个吨= 0.44. 最初四个对照记录的平均结果是，λ= 1.67,α=0.27；对于低渗介质中的曲线，λ= 1.80,α= 0.10; 对于返回到控制介质的四条记录，λ= 1.57,α= 0.34.B类.500 mosmole kg的激发效果−1ACSF公司。实验与面板A中所示的相似，只是高渗介质为500 mosmole kg−1使用培养基。对于B组中的所有记录，第页=132微米，n个吨= 0.29. 最初四个对照记录的平均结果是，λ= 1.77,α= 0.20; 高渗介质中的四条曲线，λ= 1.72,α= 0.37; 四条记录返回控制介质，λ=1.88，α= 0.13.C、。的行为比较λ用RTI-TMA方法测量，用IOI测量3kDa右旋糖酐，行为α（用RTI-TMA测量）。根据参考文献计算的右旋糖酐数据。随着渗透压降低到控制值以下（305摩尔kg），用两种分子测量的扭曲度线性增加−1)，但用较大分子（右旋糖酐）测量的斜率大于用较小分子（TMA）测量的+). 在高渗ACSF中λ用两个分子测量很快达到一个恒定值，λ0= 1.67. 相反，α随渗透压变化平稳单调，低渗ACSF下降，高渗介质增加。（参考183中修改的所有面板）。
图9
图9
大鼠视上核（SON）中胶质突起的收缩及其对扩散和突触串扰的影响。上排：处女和哺乳期大鼠的扩散曲线示例。SON是各向异性的，因此有三个值λ加上一个值α从这些曲线中提取的数据如图所示。下一行：上一行所示的数值和电子显微镜证据（383）表明，哺乳期大鼠SON神经元的星形细胞覆盖率降低导致谷氨酸清除不足，导致ECS中谷氨酸浓度增加，突触之间的串扰增加，突触前或突触后受体的激活增加。（改编自参考文献292、359）。
图10
图10
缺氧和缺血对皮层扩散参数的影响体内在大脑切片中。答：。心脏骤停后年轻成年和老年（28个月）大鼠的RTI-TMA测量序列。在心脏停搏前后记录皮层V层的扩散曲线，并叠加在增加的TMA上+ECS卷收缩导致的基线。图中所示的扩散参数（修改自参考文献363）。B。大鼠皮层的详细曲线体内在缺氧期间，与常压相比，由于氧自由基的急剧减少，扩散曲线发生了巨大变化α以及更温和但仍然显著的增长λ（Syková等人，未出版）。C、。暴露于缺氧介质和气体前后的皮层切片。请注意，更改没有遇到的更改大体内（修改自参考文献290）。D。对照大鼠皮层和缺血皮层的DW-MRI测量。还使用RTI-TMA进行了测量，DW-MRI图像下方显示了参数（Syková等人，未发表）。
图11
图11
结合使用RTI-TMA和IOI方法研究死空间微域。一个1-一个3RTI-TMA研究。一个1独立离子电泳微电极和ISM在正常400μm薄片和1000μm“厚”薄片中的放置示意图。厚厚的切片代表了缺血组织的模型。一个2.TMA公司+脑片扩散曲线。天猫+脉冲施加50 s（水平条）并由TMA检测+-ISM距离100μm。扩散曲线与理论曲线叠加（方程式13和15）。400（蓝色曲线）和1000μm新皮质“厚”切片（红色曲线）的代表性记录。正如预期的那样，缺血切片的扭曲度较高，体积分数较低。一个3.在浴中用70 kDa右旋糖酐培养1000μm切片的代表性记录（黑色曲线）；这导致了曲折性的自相矛盾的下降。为了进行比较，在没有右旋糖酐的情况下培养1000μm切片的扩散曲线（红色曲线）如A所示2叠加（修改自参考文献148）。B。使用IOI研究添加的背景分子（70 kDa右旋糖酐，无荧光标记）对3 kDa葡聚糖荧光分子（fdex3）扩散的影响。顶部图像行：fdex3在压力注射后立即（标记为0秒）以及60、120和180秒后在新皮质厚切片中拍摄的图像。伪彩色显示的强度（红色最高，蓝色最低）代表组织中fdex3的浓度。上面一行的图像是在没有背景大分子的情况下拍摄的（没有宏。）。下一行的图像中含有非荧光dex70。沿着穿过图像中心的水平线获得的数据强度分布（底部）。在dex70的存在下，图像强度消散得更快，因此曲线（蓝色）的塌陷更为明显。在无dex70和有dex70的情况下，扭转分别为3.66和2.37。（修改自参考文献147）。C、。据推测，在缺血和其他病理条件下，随着水从细胞外流向细胞室，细胞元件的体积扩大，一些间质平面形成阻塞。进入这些口袋状区域的扩散分子被延迟，扭曲度增加（左图）。当背景大分子，如dex70，被添加到这个组织中时，它们被困在死空间中。通过排除死空间体积，dex70可以防止标记分子在那里延迟，并减少扭曲度（右图）。（修改自参考文献147）。
图12
图12
左图：研究脑肿瘤组织的苏木精和伊红染色以及插图中所示的相应免疫标记（详见参考文献）。右：在每种不同类型的肿瘤中记录的具有代表性的TMA扩散曲线，以及ECS扩散参数的相应值α和λ。答：毛细胞性星形细胞瘤（WHO I级）。B类：弥漫性原纤维星形细胞瘤（WHO II级）。抄送：间变性星形细胞瘤（WHO III级）。医生：胶质母细胞瘤（WHO IV级）。比例尺=50μm适用于每张显微照片。（修改自参考文件402）。
图13
图13
细胞外微环境和体积传递。上部面板突触和整个ECS嵌入密度未知的细胞外基质中。细胞外基质有几种成分，包括选择性蛋白、腱蛋白-R（TN-R）、发育中的大脑中的腱蛋白-C和透明质酸（HA）。G、 胶质细胞；N、 神经元。（修改自参考文献421）。下部面板.细胞外通讯。短距离通信。这通过典型的突触传递的闭合突触发生。这些突触通常被神经胶质突起和细胞外基质包裹，形成神经元周围或突触周围网络。ECS根据神经元活动和胶质细胞重排改变其扩散参数。在通过扩散进行的短距离通信中，突触前终末、突触后终末、胶质细胞突起和ECS形成一个“可塑”的四边形突触。远程通信。中枢神经系统结构由神经元、轴突、胶质细胞、细胞进程、细胞外基质分子和细胞间的细胞间通道组成。这种结构减缓了大脑中物质的运动（扩散），这在很大程度上取决于ECS扩散参数体积分数(α)，曲折(λ)在某些情况下，损失或吸收(k个′). （修改自参考文献358）。
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