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.2008年12月；19(12):5360-72.
doi:10.1091/mbc.e08-01-0080。 Epub 2008年10月8日。

Beclin 1与哺乳动物Atg14和UVRAG形成两种不同的磷脂酰肌醇3-激酶复合物

板仓英介 1, Chieko Kishi先生, 井上金二, Noboru水岛
附属公司

Beclin 1与哺乳动物Atg14和UVRAG形成两种不同的磷脂酰肌醇3-激酶复合物

板仓英介等。 分子生物学细胞. 2008年12月.

摘要

III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3激酶）调节多膜运输。在酵母中，已知两种不同的PI3-激酶复合物：复合物I（Vps34、Vps15、Vps30/Atg6和Atg14）参与自噬，复合物II（Vps34Vps15，Vps30/A tg6和Vps38）在空泡蛋白分选途径中起作用。Atg14和Vps38在诱导这两种配合物发挥不同功能方面很重要。在哺乳动物中，Vps34、Vps15和Vps30/Atg6的对应物分别被鉴定为Vps34，p150和Beclin 1。然而，Atg14和Vps38的同源序列仍然未知。我们鉴定了Atg14和Vps38的假定哺乳动物同源物。Vps38候选基因与紫外线辐射抗性相关基因（UVRAG）相同，该基因已被报道为Beclin-1相互作用蛋白。虽然人类Atg14和UVRAG都与Beclin 1和Vps34相互作用，但Atg14与UVRAG并不存在于同一复合物中。尽管Atg14存在于自噬隔离膜上，但UVRAG主要与Rab9阳性内体相关。HeLa细胞中人Atg14的沉默可抑制自噬体的形成。与Vps34和Beclin 1结合所需的Atg14的卷曲螺旋区对于自噬是必不可少的。这些结果表明哺乳动物细胞至少有两种不同的III类PI3-激酶复合物，它们可能在不同的膜转运途径中发挥作用。

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数字

图1。
图1。
鉴定Atg14和Vps38的哺乳动物对应物。（A） 氨基酸比对智人附件14（KIAA0831；国家生物技术信息中心[NCBI]登录号NP_055739），附件14为酿酒酵母（注册号NP_009686）和光滑梭菌（登录号XP_445209）。使用CLUSTAL W生成比对。相同的残留物用填充框表示。（B） 氨基酸比对智人UVRAG（NCBI登录号NP_003360），Vps38酿酒酵母（注册号NP_013464）和光滑乳杆菌（登录号XP_445209）。（C） KIAA0831（Atg14）和UVRAG在小鼠组织中普遍表达。将小鼠组织中的总RNA反转录成cDNA，然后用指定的引物进行PCR扩增。（D） Atg14、KIAA0831、UVRAG和Vps38同源物的系统发育分析。基于这些同源物的氨基酸序列，使用CLUSTAL W构建未根系统发育树。基于距离矩阵的树是通过NJ方法构建的（Saitou和Nei，1987）。（E） 结构比较酿酒酵母附件14，智人附件14（KIAA0831），酿酒酵母Vps38和智人UVRAG公司。线圈域由Lupas算法预测等人。（1991年）。
图2。
图2。
Atg14和UVRAG与Beclin 1-Vps34形成两种不同的复合物。（A） 人Atg14和UVRAG包含在不同的Beclin 1复合物中。用FLAG-UVRAG、HA-Beclin 1和Myc-Atg14共同转染HEK293T细胞，并使用HA、Myc和FLAG抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀。用所示抗体通过免疫印迹分析检测所得沉淀物。（B） Atg14和UVRAG与Vps34的N末端C2结构域相互作用。HEK293T细胞与HA-UVRAG、HA-Atg14和FLAG-Vps34（全长）、FLAG-Vps 34N（含C2结构域，1-282氨基酸残基）或FLAG-Vpsi 34C（283-887氨基酸残基。使用HEK293T细胞的裂解液与指定的抗血清进行免疫沉淀。（D） Atg14与p150形成蛋白质复合物。通过免疫沉淀和免疫印迹分析瞬时表达FLAG-p150和HA-Beclin 1或HA-Atg14的HEK293T细胞的裂解物。
图3。
图3。
Beclin 1和Vps34对Atg14和UVRAG的表达水平很重要。（A）用指示的siRNA处理HeLa细胞。用指示的抗体制备总细胞裂解物并通过免疫印迹分析。（B） 每个siRNA对mRNA表达水平的影响。用指示的siRNA处理HeLa细胞72小时，并用实时PCR测定mRNA水平。数据表示为六个PCR反应的平均值±SE。
图4。
图4。
Atg14定位于隔离膜上。将稳定表达GFP-Atg14的NIH3T3细胞在常规DMEM或无FBS的无氨基酸DMEM中培养2h，然后固定、渗透细胞，并使用大鼠抗GFP抗体和多克隆抗LC3（A）、抗Atg5（B）或抗Atg16L1（C）抗体进行免疫荧光显微镜检查。Atg14和LC3的正结构用箭头表示，LC3的正负结构用箭头指示。棒材，10μm。
图5。
图5。
Atg14点的形成与PI3-激酶活性无关。（A和B）Wortmanin抑制Atg16L1的点刺形成，但不抑制Atg14的点刺生成。将稳定表达GFP-Atg14的NIH3T3细胞培养在常规DMEM或无FBS的无氨基酸DMEM中，在有或无200 nM沃特曼的条件下培养1h。然后，固定、渗透细胞，并使用大鼠抗GFP抗体和兔抗Atg16L1抗体进行免疫荧光显微镜检查。棒材，10μm（A）。Atg16L1-在有或无沃特曼的饥饿条件下，Atg14点刺的阳性率以百分比（B）表示。数据表示为至少10个细胞的平均值±SD。（C） Atg14通过线圈域与Vps34和Beclin 1相互作用。从稳定表达HA-Atg14或HA-Atg14-ΔCC的NIH3T3细胞和瞬时表达HA-Atg14或HA-Atg14-△CC的HeLa细胞制备裂解物，然后使用抗HA抗体进行免疫沉淀分析。（D） Atg14定位在隔离膜上，与Vps34无关。稳定表达HA-Atg14或HA-Atg14-ΔCC的NIH3T3细胞在常规DMEM或无FBS的无氨基酸DMEM中培养1h，然后固定、渗透细胞，并使用小鼠抗HA抗体和多克隆抗LC3或抗Atg16L1抗体进行免疫荧光显微镜检查。两个标记都为阳性的结构由箭头表示。棒材，10μm。
图6。
图6。
UVRAG定位于Rab9阳性的晚期内体。用FLAG-Rab9（E和G）或HA-Rab9（F）瞬时转染稳定表达GFP-UVRAG（A、C和E）、GFP-LC3（B）或GFP-Atg14（D和G）的NIH3T3细胞（F）和NIH3T_3细胞24小时。固定后，用大鼠抗GFP（A–E和G）、兔抗LC3（A）、兔抗体Atg16L1（C）、兔对抗FLAG（E和G，小鼠抗HA（F）或兔抗UVRAG（B、D和F）抗体对细胞进行免疫细胞化学。绿色和红色信号的正结构用箭头表示，绿色或红色信号的负结构用箭头指示。棒材，10μm。
图7。
图7。
Vps34定位于UVRAG阳性点和饥饿诱导的Atg14阳性点。生成稳定表达Vps34-GFP和HA-UVRAG（A）或HA-Atg14（B）的NIH3T3细胞。（B） 通过在无FBS的无氨基酸DMEM中培养细胞2 h，使细胞遭受饥饿。固定后，使用大鼠抗GFP和小鼠抗HA抗体对细胞进行免疫细胞化学。绿色和红色信号的正结构用箭头表示。棒材，10μm。
图8。
图8。
Atg14和Vps34是自噬体形成所必需的。（A–C）Atg14（A和B）和Vps34 siRNA（C）处理的细胞自噬流量减少。在常规DMEM或饥饿培养基中，在有或无氯喹（20μM）或E64d（50μM）和胃蛋白酶抑制素A（50μg/ml）的情况下，用指示的siRNA处理HeLa细胞，培养1小时（A）或2小时（B和C）。用所示抗体通过免疫印迹法分析细胞的总裂解物。（D和E）用A–C中所述的Atg14和Vps34 siRNA处理稳定表达GFP-LC3的HeLa细胞，并饥饿2小时。巴，10μm（D）。饥饿细胞中GFP-LC3点的总面积与细胞总面积的比率以百分比表示。数据表示为至少10个不同字段（E）的平均值±SD。用对照或Atg14 siRNA处理的（F和G）HeLa细胞饥饿2 h，并进行常规电子显微镜分析。箭头表示自噬体。棒材，1μm（F）。通过形态计量分析确定自噬体总面积与细胞质总面积的比值。使用MetaMorph图像分析软件（G）对每个样本的10个细胞进行分析。（H） 用UVRAG siRNA处理的HeLa细胞在有或无氯喹（20μM）的饥饿培养基中孵育1 H。（I和J）用UVRAG siRNA治疗的稳定表达GFP-LC3的HeLa细胞饥饿2 H，观察到GFP-LC3puncta。棒材，10μm（I）。饥饿细胞中GFP-LC3点的总面积与细胞总面积的比率以百分比表示。数据表示为至少10个不同字段（J）的平均值±SD。
图9。
图9。
Atg14ΔCC突变不能挽救Atg14敲除细胞的自噬缺陷表型。用所示的siRNA处理（A和B）HeLa细胞。2天后，将细胞瞬时转染空载体HA-Atg14*（星号[*]表示siRNA-resistance版本）或HA-Atg14ΔCC*质粒，再与相同的siRNA一起培养2天。再次用相同的表达载体转染细胞并再培养1d。然后，将细胞在饥饿培养基中培养2h。制备总裂解物，并测定p62表达水平（A）和LC3周转率（B）。
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参考文献

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