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.2008年10月14日；105(41):15702-7.
doi:10.1073/pnas.0804842105。 Epub 2008年10月7日。

内质网膜中蛋白质插入的分子代码与N（in）-C（out）和N（out）-C的跨膜螺旋相似

卡罗琳娜·伦丁 1, Hyun Kim先生, 英格玛丽·尼尔森, 斯蒂芬·怀特, 冈纳·冯·海恩
附属公司

内质网膜中蛋白质插入的分子代码与N（in）-C（out）和N（out）-C的跨膜螺旋相似

卡罗琳娜·伦丁等。 美国国家科学院程序. .

摘要

完整膜蛋白中的跨膜α-螺旋在膜上可以有两个方向：N（in）-C（out）或N（out）-C。以往对模型N（out）-C（in）跨膜片段的研究已经得出了一个详细的定量“分子密码”图，该“分子密码“将氨基酸序列与体内膜插入效率联系起来【Hessa T，et al.（2007）Sec61转座子跨膜螺旋识别的分子密码。自然450:1026-1030】，但同样的代码是否也适用于N（in）-C（out）跨膜螺旋尚不清楚。这里，我们表明，对于两种螺旋，单个氨基酸对膜插入总效率的贡献是相似的，与N（out）-C（in）跨膜螺旋相比，N（in）-C，取决于相邻的螺旋线。

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图1。
图1。
N的膜插入外面的–C在里面和N在里面–C外面的跨膜螺旋。(A类)H段（红色）作为易位新生链的一部分进入易位子，并与N整合到膜中外面的–C在里面方向。H段下游的新生链仍留在胞浆中。(B类)H段进入易位子触发了新生链下游部分的易位。H段与N结合在膜中在里面–C外面的方向。
图2。
图2。
膜整合分析。(A类)模型蛋白质。(左侧)在用于分析N的构造中外面的–C在里面H段，H段（红色）的膜插入只产生G1位点上的糖基化分子，而H段跨膜移位产生G1和G2位点上糖基化的分子（5）。(赖特)在这里用于分析N的构造中在里面–C外面的H段，当H段插入细胞膜时，G1和G2受体位点都被修饰，而当H段留在细胞液中时，只有G1位点被修饰。箭头表示信号肽酶裂解位点的位置。(B类)将成分为1D/4L/14A的H段整合到狗胰腺RMs中（构造46英寸表S1)。转录并翻译编码Lep结构的质粒在体外在RMs、DMSO（信号肽酶抑制剂）不存在（−）或存在（+）的情况下N个-甲氧基琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Val-氯甲基酮（SP-I）溶解在二甲基亚砜中，或经过内氢处理。安在体外车道6中包含了构造46的翻译版本，该构造46在H段C末端（构造ΔN）的GPGG侧面缺少N末端域。(C类)集成体内将所述组合物的HA标记的含有Lep的H段（构建体86、88–90表S1; P2结构体中的H段是一个主要由来自Lep P2结构域的极性氨基酸组成的19-残基肽）。在SDS/PAGE和用HA抗血清进行Western印迹之前，用endo H消化每个样品的一分之一，以去除N-连接聚糖。(D类) [35S] 3L/16A H段结构的Met脉冲标记（89；表S1)HFY406菌株携带ts秒信号肽酶复合物的Spc3p亚基的突变。在允许温度（25℃）或非允许温度（37℃）下对细胞进行预处理和脉冲标记，用HA抗血清免疫沉淀HA标记的Lep。(B–D类)显示了非糖基化（0G）、单糖基化和双糖基化产品。信号肽酶裂解产生的糖基化和未糖基化产物分别用*和o表示，只有在酵母中才能看到的未糖基裂解产物用C类.
图3。
图3。
残留物对Δ的特定贡献G公司应用程序. (A类) ΔG公司应用程序N的值在里面–C外面的组合物的H段n个L/（19-n个)A测量单位在体外在RM在场的情况下进行翻译(n个= 0–3; 构建体1-4，表S1; 固体线）和在酵母中的表达(n个= 1–3; 构造87–89，表S1; 点划线）。为了进行比较，ΔG公司应用程序N中相同H段的值外面的–C在里面方位(囊性纤维变性.图2A类)也显示了（虚线）（5）。(B类)实验测量ΔG公司应用程序根据预测Δ绘制的值G公司pred（前）所有N的计算值如参考中所述在里面–C外面的使用中列出的RM系统分析H段表S1实线的方程式为ΔG公司应用程序= ΔG公司pred（前）−1.23 kcal/mol，其中1.23 kcal/mol是Δ之间差异的平均值G公司应用程序以及相应的ΔG公司pred（前）图中的值。虚线表示实线的间隔为±0.5 kcal/mol。(C类)Δ之间的相关性G公司应用程序X（X）当放置在H段中间时，测定N的20个氨基酸的值在里面–C外面的H型分段(表S2)和N外面的–C在里面H段（3）。
图4。
图4。
以N末端H段为靶点并插入构建物。(A类)模型蛋白质。如果H段形成N外面的–C在里面跨膜螺旋，只有G1受体位点会被修饰(左侧); 如果插入相反的N在里面–C外面的方向，G2和G3站点将被修改(赖特)。如果蛋白质不能插入膜，就会产生未糖基化的蛋白质。(B类)体外所示结构的翻译（96–102，表S1)在没有（−）或存在（+）RM的情况下，表示未糖基化（0G）、单糖基化的（1G）和双糖基化产品。(C类)凝胶中的糖基化产物（1G+2G）百分比B类.
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