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.2008年10月7日；105(40):15323-7.
doi:10.1073/pnas.0801376105。 Epub 2008年10月1日。

脾因子癌蛋白SF2/ASF激活mTORC1

罗特姆·卡尼 1, 吉隆河马, 斯科特·W·洛, 阿德里安·克莱纳
附属公司

脾因子癌蛋白SF2/ASF激活mTORC1

罗特姆·卡尼等。 美国国家科学院程序. .

摘要

剪接因子SF2/ASF是一种在许多癌症中上调的癌蛋白，当稍微过表达时，可以转化不朽的啮齿动物成纤维细胞。mTOR信号通路在许多癌症中被激活，该通路的药物阻断剂正在作为抗癌药物进行临床试验。我们检测了SF2/ASF转化细胞中mTOR通路的活性，发现该剪接因子激活了通路的mTORC1分支，如S6K和eIF4EBP1磷酸化所测。这种激活是mTORC1特有的，因为没有检测到mTORC2底物Akt的激活。SF2/ASF激活mTORC1绕过上游PI3K/Akt信号传导，对SF2/ASF-介导的转化至关重要，因为雷帕霉素对mTOR的抑制在体内外阻断了SF2/ASF的转化。此外，shRNA介导的mTOR或特异性mTORC1和mTORC2成分的敲除Raptor和Rictor，可消除过度表达SF2/ASF的细胞的致瘤潜能。这些结果表明，SF2/ASF上调的临床肿瘤对mTOR抑制剂特别敏感。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
SF2/ASF激活mTOR，绕过Akt激活。(A类)MEF细胞感染了编码SR蛋白家族四种剪接因子cDNA（SF2/ASF、SRp55、SC35和SRp30c）和hnRNP A/B蛋白hnRNP A1的逆转录病毒，这些逆转录病毒融合到N末端的T7标签上，或仅与pBABE载体融合。选择后，将细胞进行电镀（106每个10-cm板中的细胞），24小时后在SDS样品缓冲液中溶解。使用指示的一级抗体进行蛋白质印迹。抗磷酸化S6K1的抗体可识别p70和p85，这两种蛋白的翻译起始位点不同（27）。(B类)表达高水平SF2/ASF的NCI-H460肺癌细胞感染空逆转录病毒载体（LMP）或编码SF2/ASF-特异性shRNA（shSF2-1）的LMP或带有两个错配的对照shRNA（sh SF2-m）。选择后，如上所述对细胞进行裂解。使用所示的一级抗体进行蛋白质印迹。(C类和D类)NIH 3T3和MEF细胞按照A类，并在选择后溶解。用所示抗体对蛋白印迹进行检测。(电子)用指示的siRNAs转染HeLa细胞，72小时后进行裂解D类4E-BP1磷酸化C–E类通过其向γ形式的迁移率变化检测到（28）。
图2。
图2。
SF2/ASF介导的转化需要mTOR活性在体外和体内. (A类)如图所示，在存在雷帕霉素或载体对照的情况下，用SF2/ASF、hnRNP A1或致癌Ras转导的NIH 3T3细胞的软琼脂中菌落形成的定量。不含雷帕霉素的平均值设置为100%；误差条表示标准偏差(n个= 3). (B类)中描述的软黄菌落的代表性领域A类. (C类)将转染SF2/ASF的NIH 3T3细胞注入裸鼠体内。允许肿瘤大小达到≈200 mm三然后每天腹腔注射雷帕霉素4mg/kg或溶媒对照。(D类)Ras转导的NIH 3T3细胞第12版注射，小鼠按C类。治疗期间测量肿瘤体积。当肿瘤大小达到1500毫米时，处死动物三中的错误栏C类和D类指出标准偏差的上半部分(n个= 10).
图3。
图3。
mTORC1是SF2/ASF诱导肿瘤发生所必需的。(A类)用pWZL-Hygro-SF2/ASF转导的NIH 3T3细胞用编码mTOR或猛禽特异性shRNA的逆转录病毒进行超转导。选择嘌呤霉素后，通过Western blotting分析细胞的mTOR和Raptor蛋白表达；以SF2/ASF（检测内源性和标记蛋白）、SRp55和β-catenin抗体作为对照。(B类)中描述的单元格A类每3天测量一次肿瘤体积，如图2所示C类误差条表示标准偏差(n个= 10). (C类)中描述的典型小鼠B类如图所示。
图4。
图4。
SF2/ASF介导的转化需要猛禽和Rictor。(A类)用pWZL-Hygro-SF2/ASF转导的NIH 3T3细胞与编码猛禽或蓖麻特异性shRNAs的逆转录病毒或空LMP载体进行超转导。选择嘌呤霉素后，通过蛋白质印迹分析细胞中Rictor和Raptor蛋白的表达；肌动蛋白抗体作为对照。(B类)中描述的单元格A类在两次实验中用软琼脂培养。14天后对菌落进行计数。误差条表示标准偏差(n个= 2).
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