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.2008年10月；118(10):3331-42.
doi:10.1172/JCI35875。

Hedgehog信号调节啮齿类动物和人类胆道纤维化过程中的上皮-间质转化

阿莱西亚·奥梅内蒂 1, 亚历山德罗·波雷洛, 容美美（Youngmi Jung）, 刘洋, 尤里·波波夫, 史蒂夫·S·崔, 拉斐尔·维特克, 吉安弗兰科·阿尔皮尼, 朱丽叶·文特, 亨德里卡·M·万东根, Wing-Kin同步, 吉安卢卡·斯维利亚蒂·巴罗尼, 安东尼奥·贝内德蒂, Detlef Schuppan酒店, 安娜·梅·迪尔
附属公司

Hedgehog信号调节啮齿类动物和人类胆道纤维化过程中的上皮-间质转化

阿莱西亚·奥梅内蒂等。 临床研究杂志. 2008年10月.

摘要

上皮-间充质转化（EMT）在胚胎发生过程中的组织构建中起着重要作用，证据表明，这一过程也可能有助于损伤后一些成年组织的重塑。刺猬（Hh）信号通路的激活在发育过程中调节EMT。该途径也由慢性胆道损伤诱导，EMT在其中起作用。我们评估了Hh信号促进成人胆管细胞（胆管细胞）EMT的假设。在慢性胆道损伤患者的肝脏切片中，以及从接受胆管结扎（BDL）（胆道纤维化的实验模型）的大鼠分离出的原代胆管细胞中，EMT定位于具有Hh通路活性的胆管细胞。解除BDL大鼠的胆管梗阻可降低Hh通路活性、EMT和胆道纤维化。在小鼠胆管细胞中，与肌纤维母细胞肝星状细胞（可溶Hh配体的来源）共培养可促进EMT和细胞迁移。向共培养物中添加Hh中和抗体可阻断这些效应。最后，我们发现补片缺陷小鼠对BDL的EMT反应增强，表现出Hh通路过度激活。总之，这些数据表明Hh信号的激活促进了EMT，并有助于慢性胆汁淤积期间胆道纤维化的演变。

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数字

图1
图1。PBC患者的胆管细胞表达EMT标记物S100A4。
结直肠癌转移灶切除后对照组（NL）代表性切片中S100A4免疫染色(一，插图）和PBC患者(一). S100A4的PBC肝脏免疫染色(B类)和上皮细胞CK-7(C类)在罕见的导管细胞中证实两种标记物共定位(D类). 在所有对照组和患者的20个视野中，在放大倍率为20倍的条件下，对表达CK-7的导管样细胞（不含或含S100A4）进行计数。数据显示为CK-7/S100A4双阳性细胞相对于每个场CK-7单阳性细胞数量的平均数(E类)PBC患者与对照组CK7/S100A4双阳性细胞数量的平均倍数差异(F类). **P（P）<0.005. 原始放大倍数，×100(一), ×20 (一，插图），×40(B类–D类), ×100 (D类，插图）。
图2
图2。BDL诱导胆道纤维化时，大鼠胆管细胞中EMT标记物上调。
(一)全肝mRNA表达的QRT-PCR分析S100a4号机组BDL诱导的胆道纤维化大鼠(n个=8）和BDL大鼠接受R-Y治疗以缓解胆道梗阻和逆转胆道纤维化(n个=每个时间点5个）。结果与假手术大鼠的结果进行了比较(n个=4）并显示为平均值±SEM*P（P）<0.05与假对照。(B类–E类)BDL后1周大鼠新鲜分离的原代胆管细胞mRNA的QRT-PCR分析。(B类)S100a4号机组; (C类)问题1; (D类)CK19型; 和(E类)CK-7公司结果与手术后对照组新鲜分离的胆管细胞的类似mRNA分析进行了比较。数据代表3个独立实验，显示为平均值±SEM*P（P）<0.05, **P（P）<0.005与假对照相比。
图3
图3。大鼠胆道纤维化期间接受EMT治疗的胆管细胞群具有Hh反应性。
(一和B类)Hh诱导转录因子的QRT-PCR分析Gli2公司(一)和Hh配体抑制剂髋关节(B类)从1周龄BDL大鼠或假手术对照组分离的原代胆管细胞中(n个= 3). 数据显示为平均值±SEM*P（P）<0.05, **P（P）<0.005与操作不当的对照。免疫组织化学显示BDL大鼠原代胆管细胞γ-谷氨酰转肽酶（γGT）染色(C类)Ptc的表达(D类)和S100A4(E类)在相同的准备中。BDL大鼠胆管细胞S100A4/Ptc融合图像(F类)和操作不当的控制(F类，插图）。原始放大倍数，×20(C类), ×100 (D类–F类), ×20 (F类，插图）。
图4
图4。人类胆道纤维化期间接受EMT治疗的胆道细胞群具有Hh反应性。
Gli2（棕色）定位于表达S100A4的导管细胞细胞核(一)，波形蛋白(B类)和CK-7(C类)在PBC患者的代表性肝脏切片中。S100A4、波形蛋白或CK-7的阳性表现为蓝色细胞质染色。原始放大倍数，×100(一–C类).
图5
图5。肌成纤维细胞释放的可溶性因子改变了共培养胆管细胞的基因表达谱。
(一和B类)与MF-HSCs共培养的胆管细胞微阵列数据的GO分析，并与单培养胆管细胞进行比较。每个表达率高于1.500且低于0.666的基因探针被分配到其相应的GO家族。因此，GO集合是根据属于它们的基因总数进行排序的。与超过10%的选定基因相关的GO家族被丢弃，以提高GO分析的特异性。GO集合的这一亚群进一步分为两组，一组至少占该亚群的60%，另一组占剩余百分比（<40%）。然后，使用第一组GO族的单个名称生成饼图，而属于第二组的GO集被统称为“其他”(一)上调GO基因集。(B类)下调GO基因集。括号中的数字表示属于该特定家族的改变基因。原始饼图和图例如补充图1和2所示。GO家族和EASE得分的完整列表见表1和表2以及补充表2。
图6
图6。通过与肌成纤维细胞共培养在胆管细胞中诱导EMT基因谱。
(一和B类)微阵列探针分析。基于作为标准输入的Affymetrix CEL和CDF文件，通过鲁棒多芯片平均（RMA）算法计算可用Affymetrix基因芯片的探针表达值。基因探针的表达率高于1.500（上限），低于0.666（即1.500的倒数；下限），用于分析。(一)上调免疫球蛋白1rEMT信号传感器；嗯2，EMT转录调控因子；SMAD-特异性E3泛素蛋白连接酶1(蓝色1，TGF-β信号转导效应器）；和富含半胱氨酸的跨膜BMP调节器1(深红1)，显著下调Bmp7型，一种EMT拮抗剂。(B类)探针分析显示，在共培养的胆管细胞中获得了间充质表型，上皮标记物（白条）如去氨普拉金缺失，间充质标记物（黑条）如层粘连蛋白β3、纤连蛋白、丝胺、N-钙粘蛋白和S100a4号机组完整的探针分析见补充表1。(C类)通过QRT-PCR分析验证微阵列数据。共培养胆管细胞中的靶基因mRNA水平显示为相对于单培养的折叠变化。数据代表3个独立实验，显示为平均值±SEM*P（P）<0.05, **P（P）<0.005与单一培养。
图7
图7。与MF-HSC共培养可逆转胆管细胞保留上皮基因表达的倾向。
胆管细胞单独培养（单培养，白条）或与MF-HSCs（共培养，黑条）一起培养，并在3或6天后收获。进行QRT-PCR分析以评估S100a4号机组(一)以及Bmp7型(B类). 将结果与这些基因在新电镀的胆管细胞中的表达进行比较（时间0）。数据为3个实验的平均值±SEM*P（P）<0.05和**P（P）<0.005.
图8
图8。肌纤维母细胞衍生可溶性因子增加共培养胆管细胞的运动/迁移。
(一–F类)通过创伤愈合试验评估细胞迁移。胆管细胞在没有培养基的情况下培养(一和B类)或存在(C类–F类)含MF-HSC的Transwell过滤器插入物6天；然后刮除胆管细胞单层，立即获得图像（时间0；一,C类、和E类)用对照IgG治疗18小时后(B类,D类和黑条）或Hh-中和抗体（NAb）(F类和灰色条）。通过使用Image J软件测量单层膜两侧的距离来量化胆管细胞迁移(G公司)通过计算18小时后转移到伤口的细胞数量(H（H）). **P（P）<0.005与单培养，时间0(G公司)或经IgG处理的单细胞培养(H（H）);#P（P）<0.005与经IgG处理的共培养。原始放大倍数，×10(一–F类). 虚线(一–F类)指示单分子膜上切割的前缘。
图9
图9。中和肌纤维母细胞衍生的Hh配体抑制共培养胆管细胞中EMT基因表达谱。
将MF-HSC 8B系的细胞单独培养6天，并收集条件培养基。在血清饥饿18小时后，用MF-HSC条件培养基（MF-条件培养基）在对照IgG（10μg/ml；黑条）或Hh-中和抗体（10μg/ml；灰条）的存在下，对胆管细胞系603B的单细胞培养物进行额外24小时的处理。对照组胆管细胞单一培养物接受常规培养基（非MF-HSC条件培养基）（白色条）。然后进行QRT-PCR分析EMT相关基因的表达(一)和细胞标记(B类)通过与MF-HSC的共培养改变了这种情况。结果是相对于接受非条件培养基的对照胆管细胞表达的。数据代表3个独立实验，表示为平均值±SEM*P（P）<0.05与对照组胆管细胞；#P（P）<0.05与MF-HSC条件培养基加IgG处理的胆管细胞相比。
图10
图10。Hh活性增加的Ptc小鼠在BDL后EMT增加。
H&E染色的肝脏切片(一和B类)或抗CK(C类和D类)代表性WT小鼠(一和C类)和Ptc小鼠(B类和D类)BDL 1周后。Ptc小鼠全肝组织的QRT-PCR(n个=6）和他们的WT室友(n个=6）BDL 1周后。(E类)波形蛋白；(F类)胶原蛋白1α（I）；(G公司)Tgfb1型; (H（H）)嗯2; (我)Bmp7型数据显示为平均值±SEM*P（P）<0.05与WT-BDL相比**P（P）<0.005,†P（P）=0.08与WT-BDL。原始放大倍数：×20(一和B类), ×40 (C类和D类).
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中的注释

  • 胆道纤维化中的刺猬信号。
    格林鲍姆LE。 格林鲍姆LE。 临床投资杂志。2008年10月；118(10):3263-5. doi:10.1172/JCI37189。 临床投资杂志。2008 PMID：18802487 免费PMC文章。

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    格林鲍姆LE。 格林鲍姆LE。 临床投资杂志。2008年10月；118(10):3263-5. doi:10.1172/JCI37189。 临床投资杂志。2008 PMID：18802487 免费PMC文章。
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