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.2008年9月8日；182(5):911-24.
doi:10.1083/jcb.200805140。

内质网的重塑限制了核膜形成的速率

丹尼尔·安德森 1, 马丁·海策
附属公司

内质网的重塑限制了核膜形成的速度

丹尼尔·安德森等。 J细胞生物学. .

摘要

后生动物在有丝分裂期间，分离的染色体被核膜（NE）包围，核膜是与内质网（ER）相连的双层膜。最近的体外实验数据表明，NE的形成是通过染色质介导的肾小管内质网重组来实现的；然而，这种膜重塑过程的基本原理仍未明确。在这里，我们用延时显微镜对哺乳动物细胞的核膜组装进行了定量分析。从内质网小管的初始募集到染色质，大约12分钟内就会形成一个膜包裹的运输竞争性细胞核。内质网微管形成蛋白网织红3、网织红4和DP1的过度表达会抑制去甲肾上腺素的形成和核膨胀，而其敲除会加速核组装。这表明，从膜小管到片的转变是核组装的速率限制。我们的结果提供了证据，证明ER型蛋白直接参与核室的重建，ER的形态重组是体内NE形成的主要机制。

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图1。
图1。
体内内质网小管与染色质结合并塌陷。将GFP融合蛋白和H2B-td番茄转染U2OS细胞，通过实时旋转圆盘共焦显微镜进行有丝分裂成像。（A） 显示了Sec61-GFP和POM121-3GFP的初始相互作用的大图像。（B） 每30秒采集一次z堆栈，通过3D重建表征初始膜-染色质接触点。箭头表示最初的膜-染色质接触。（C） 每隔5秒对第61-GFP进行成像，以监测ER动态。（D） 每隔10秒对POM121-3GFP进行成像，以监测从内质网到形成的NE条的再分布，10μm。
图2。
图2。
从NE形成小管中去除Rtn3。（A） 用POM121-3GFP和H2B-tdTomato转染U2OS细胞，以监测POM121在形成NE处的积累。箭头指示形成NE。（B）用POM121-3GFP和Rtn3-tdTomato转染U2OS细胞，以监测这些蛋白质在形成NE处的动态定位。条形图，5μm。（C） POM121累积强度阈值选择用于定义NE形成区域（B中的绿色虚线区域）。通过NE形成（蓝色圆圈）在这些区域测量了Rtn3-td番茄的荧光强度；在外周ER（橙色方块）中也测量了强度。每30秒对细胞成像一次。
图3。
图3。
为测量NE形成动力学而开发的分析。（A） 有丝分裂期间核定位（NLS）和染色质报告基因的动态定位示意图。黄色代表NLS（绿色）和染色质（红色）在完整细胞核中的共定位。（B） 将NLS与3GFPs（GFP-NLS）和H2B-tdTomato融合后转染U2OS，每隔30秒用活细胞共聚焦显微镜进行有丝分裂成像。棒材，20μm。（C） 染色体分离后，选择染色质上的区域，并随时间测量GFL-NLS强度。时间=0表示染色单体簇完全分离，蓝色和橙色痕迹表示GFP-NLS在每个子核中的核内流。
图4。
图4。
ER小管形成蛋白延迟NE的形成。用GFP-NLS和H2B-tdTomato（对照）、V5标记的ER形状蛋白（Rtn3、Rtn4或DP1）或V5标记ER蛋白Sec61β转染U2OS细胞，然后分析NE的形成。（A） 显示了NE形成期间核GFP-NLS强度的代表性痕迹。（B） 从染色体分离到核聚积开始的平均时间用标准误差条绘制。
图5。
图5。
NE蛋白募集不会因Rtn4过度表达而延迟。建立实时显微镜检测GFP融合蛋白对形成NE的募集。（A）U2OS细胞转染H2B-tdTomato和Sun1-GFP，无论是否过度表达V5-Rtn4，每隔30秒通过有丝分裂成像。选择染色质周围的一个薄区域（NE区域）来测量形成NE时Sun1-GFP的强度。（B）从染色体分离开始，在对照细胞（红色）或表达V5-Rtn4的细胞（绿色）的NE区域测量POM121-3GFP的荧光强度，然后进行归一化、平均、，并用标准误差线绘制。（C） 如在B中一样分析表达Sun1-GFP的细胞。（D）U2OS细胞被分组以获得GFP-Sec61的高（红色）和低（绿色）表达，并且如在A中一样在形成NE处测量荧光强度。（E）如在D中一样分析表达GFP-Rtn3的细胞。（F）如在D中一样分析表达DP1-GFP的细胞。每个GFP融合蛋白的相间定位如B–F中的插图所示。棒材：（A）10μm；（B） 5微米。
图6。
图6。
东北缘的形成因Rtn4的过度表达而延迟。用Sec61-GFP和H2B-tdTomato转染U2OS细胞，每隔30秒用共焦显微镜实时成像，以量化膜边缘形成所需的时间。（A） 图6所示的募集测定用于测量对照细胞（红色）和过表达Rtn4的细胞（绿色）中Sec61-GFP的募集。（B） 对对照细胞和表达V5-Rtn4的细胞进行成像，以聚焦于形成NE处的膜动力学（底部行的高倍视图）。（C） 测量并平均从染色体分离到核边缘形成的时间。误差条表示标准误差。
图7。
图7。
网织物的击倒加速NE的形成。（A） 用Sec61-GFP和针对Rtn1、Rtn3和Rtn4（3Rtn-siRNA）的干扰RNA寡核苷酸或siRNA寡核苷酸转染U2OS细胞。然后用共焦显微镜分析ER形态。棒材，20μm。（B） 如图5所示，使用NE形成动力学分析方法分析用干扰RNA或3Rtn-siRNA转染的细胞。（C） 细胞核边缘分析如图6所示，用打乱RNA或3Rtn-siRNA转染细胞。（D）NE形成时间是打乱RNA和3Rtn-siRNA转导细胞的平均值。误差条代表标准误差。（E） 平均从染色体分离到边缘形成的时间。误差条表示标准误差。
图8。
图8。
Rtn4抑制了核膨胀。用GFP-NLS转染U2OS细胞，从有丝分裂到G1每10分钟通过共聚焦显微镜获取z堆栈进行3D成像。（A） 对照细胞和过度表达V5-Rtn4的细胞的核表面从z堆重建。（B） GFP-NLS核积累后，膨胀核的表面积开始同步，然后平均。误差条表示标准误差。（C） 示意图显示了ER形状蛋白浓度对NE形成和扩展的影响，其中ER以深灰色表示，染色质以蓝色表示，红色表示形成NE。
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