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.2008年9月15日；181(6):3877-86.
doi:10.4049/jimmunol.181.6.3877。

细胞因子介导的人单核吞噬细胞对纤维状淀粉样β肽降解的抑制

山本正司1, 清田富美, 香农·M·沃尔什, 刘建诺, 乔纳森·基普尼斯, 池州市Tsuneya Ikezu
附属公司

细胞因子介导的人单核吞噬细胞对纤维状淀粉样β肽降解的抑制

山本正正等。 免疫学杂志. .

摘要

AD动物模型和患者的疫苗治疗强烈表明，大脑单核吞噬细胞在免疫介导的大脑淀粉样β肽（Abeta）清除中发挥积极作用。虽然巨噬细胞对Abeta的摄取可由促炎和抗炎细胞因子调节，但它们对巨噬细胞介导的Abeta降解的影响尚不清楚。为了更好地理解这种降解机制，我们使用原代培养的人类单核细胞衍生巨噬细胞（MDM）和小胶质细胞，通过对纤维和低聚物（125）I-Abeta40和Abeta42的脉冲相分析，检查促炎细胞因子和抗炎细胞因子是否影响Abeta的降解。纤维Abeta40和Abeta42的初始摄取量为40%，其在MDM和小胶质细胞中的降解在120小时内达到饱和，而低聚物Abeta的初始摄取小于0.5%，24小时内的降解饱和。IFN-gamma通过抑制降解，增加了纤维Abeta 40和Aberta42的细胞内滞留，而IL-4、IL-10和TGF-β1，而不是IL-13和IL-27，促进了降解。MDM中Abeta纤维降解对溶酶体和胰岛素降解酶抑制剂敏感，但对蛋白酶体和neprilysin抑制剂不敏感。IFN-γ和TNF-α直接降低胰岛素降解酶和伴侣分子（热休克蛋白70和热休克同源蛋白70）的表达，这些分子参与聚集蛋白的重折叠。MDM与活化但非原始T细胞共培养，抑制了MDM中Abeta降解，这部分被中和抗体与促炎细胞因子的结合所阻断。这些数据表明，促炎性细胞因子抑制MDM中Abeta降解，而选择性抗炎和调节性细胞因子拮抗这些作用。

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数字

图1
图1。骨髓源性巨噬细胞AcLDL和Aβ吞噬功能
A类，Aβ40原纤维（左）和低聚物（右）的AFM图像。比例尺，500 nm。B–F类，MDM（50万个细胞/孔，96 well板）与125I-AcLDL公司(B类),125I-Aβ40原纤维(C类),125I-Aβ42原纤维(D类),125I-Aβ40低聚物(E类)或125I-Aβ42低聚物(F类)用于脉冲标记。培养1小时后，用新鲜培养基在37°C下培养细胞0–120小时。在每个时间点，细胞内（黑色方形）、TCA-可溶性（浅灰色三角形；降解形式）和TCA-沉淀（深灰色倒三角形；完整形式）部分125I-AcLDL，125I-Aβ40或125计算培养基中的I-Aβ42，并将其表示为每个时间点所有组分的总计数百分比。插入（英寸）E类和F类是0-8小时之间的高放大区域。GH公司，人小胶质细胞（100000个细胞/孔，48周板）与125I-Aβ40原纤维(G公司)或125I-Aβ42原纤维(H（H）)，然后执行与MDM相同的步骤。
图2
图2。促炎细胞因子对Aβ降解的影响
MDM公司(A–F)或小胶质细胞(G–L)脉冲标记为聚集125I-Aβ40(A–C、G–I)或125I-Aβ42(D–F型,J–L型)在有或无人IFN-γ和TNF-α组合的情况下，用新鲜组织培养基培养120小时（所有细胞因子最终浓度为10 ng/ml）。追踪后，收集总细胞裂解物并进行γ计数，γ计数代表细胞内125I-Aβ保留(A、 D、G、J)，细胞外TCA-可溶性125I-Aβ(B、 E、H、K)和不溶物125I-Aβ组分(C、 F、I、L)由γ计数器收集并计数。每个分数表示为总百分比125I-Aβ（每组各分数的总和）。*、**、***表示ANOVA和Newman-Keuls确定的与对照MDM或小胶质细胞组（开放柱）相比p<0.05、0.01、0.001事后（post-hoc）.未注明。；无统计学差异。
图3
图3。抗炎细胞因子对Aβ降解的影响
A–C，MDM被脉冲标记为聚集125I-Aβ40，在存在或不存在人IL-4、IL-10、IL-13、IL-27和TGF-β1（所有细胞因子在最后10 ng/ml时）的情况下，用新鲜组织培养基培养120小时。D–I型，MDM被脉冲标记为聚集125I-Aβ40(D–F型)或125I-Aβ42(G–H（G–H）)在有或无人IL-4、IL-10和TGF-β1组合的情况下，用新鲜组织培养基培养120小时（所有细胞因子最后为10 ng/ml）。追踪后，收集总细胞裂解物并进行γ计数，γ计数代表细胞内125I-Aβ保留(A、 D、G)，细胞外TCA-可溶性125I-Aβ(B、 E、H)和不溶物125I-Aβ组分(C、 F、I)由γ计数器收集并计数。每个分数表示为总百分比125I-Aβ（每组各分数的总和）。*、**、***表示与对照MDM组（开放柱）相比，p<0.05、0.01、0.001，由方差分析和Newman-Keuls事后分析确定。
图4
图4。MDM中Aβ聚集体的共焦成像
将原代培养的MDM与1μM丝状菌Aβ40孵育1小时，用组织培养基培养5天，并通过器官标记物/酶进行免疫荧光共焦显微镜成像(A–G、O–U，红色）和抗Aβ抗体(H–N型，单克隆或多克隆，绿色）。O–U，中相应图像的合并图像A–G和O–U型箭头表示两种颜色之间的共同局部染色。原始放大倍数：400X。LAMP1，溶酶体膜糖蛋白1（溶酶体标志物）；石斑鱼类；胰岛素降解酶；20S（20S蛋白酶体标记）；HSP70、热休克蛋白70（伴侣分子，攻击性标记物）；M6P-R，甘露糖-6-磷酸受体（晚-内体标记物）；波形蛋白（界面标记物）；COPI，外壳蛋白I（顺高尔基标记物）。
图5
图5。溶酶体和IDE抑制剂抑制Aβ降解
用纤维脉冲标记MDM125I-Aβ40，在存在或不存在活化T细胞（500000个细胞/孔）、氯喹（50μM）、杆菌肽（1 mg/ml）、乳胱氨酸（5μM）或硫丙嗪（10μM）的情况下，用新鲜组织培养基培养120小时。细胞内125I-Aβ保留(A类)，细胞外TCA-可溶性125I-Aβ(B类)和不溶物125I-Aβ组分(C类)通过γ计数器收集和计数。每个分数表示为总百分比125I-Aβ（每组各分数的总和）。**表示ANOVA和Newman-Keuls post-hoc测定的与对照MDM组（开放柱）相比p<0.01。
图6
图6。IFN-γ和TNF-α共同刺激可减少IDE和伴侣分子
A类用小鼠IFN-γ（10 ng/ml）和TNF-α（10 ng/ml）刺激120小时，从人MDM（2,00000个细胞/孔）中提取细胞裂解物（20μg/lane），进行SDS-PAGE和免疫印迹，并用抗IDE（1:6000）、抗HSC70（1:3000）、抗热休克蛋白70（1:100000）或抗β-肌动蛋白（1:5000000）抗体进行免疫印迹。B–D类，IDE中A免疫反应带的定量(B类)，HSC70(C类)和HSP70(D类).I+T；IFN-γ和TNF-α治疗组。用台风成像系统（Amersham Pharmacia Biotech）对谱带强度进行量化，用β-肌动蛋白谱带强度标准化，并以β-肌动蛋白比值表示。*表示p<0.01，与学生的对照组相比t吨-测试。
图7
图7。共培养活化T细胞抑制巨噬细胞Aβ降解
A类，原代培养的人MDM（500000个细胞/孔）用纤维脉冲标记125I-Aβ40（200000 cpm/孔）培养1小时，并在0.3×10的温度下，在有无幼稚（na-T）或活化T细胞（ac-T）的情况下，用新鲜组织培养基培养120小时6（0.3m）或1×106Transwell嵌件中的电池（1m）(A类).追逐后，收集总细胞裂解物并进行γ计数，这表示细胞内125I-Aβ保留（开放柱）。组织培养基经过10%TCA沉淀，以分离细胞外TCA可溶性125I-Aβ（虚线柱）和不溶物125I-Aβ（封闭柱）。每个分数表示为总百分比125I-Aβ（每组各分数的总和）。*、#或+表示p<0.05，而对照MDM组的分数与ANOVA和Newman-Keuls测定的分数相同事后安排。B–D类，Aβ降解的时间过程研究。125I-Aβ40脉冲标记MDM与1×10共培养6将原始或活化T细胞插入Transwell中72小时和120小时。B类，细胞内滞留。C类，TCA-可溶细胞外部分。D类，TCA不溶性细胞外部分。*表示在双向方差分析和Bonferroni后验确定的同一时间点，与对照组或幼稚T细胞共培养MDM组相比p<0.001。
图8
图8。前炎性细胞因子中和抗体对Aβ降解的影响
用纤维脉冲标记人MDM125I-Aβ40培养1小时，并在有、无或有抗IFN-γ（αIFN-γ）、抗TNF-α（αTNF-γ）、反CD40L（αCD40L）和对照小鼠IgG（Con-IgG，均来自R&D Systems，最终浓度为1μg/ml）的情况下，用含有（第2-10列）或不含（第1-14列）活化T细胞（ac T）的新鲜组织培养基培养120小时。细胞内125I-Aβ保留(A类)，细胞外TCA-可溶性125I-Aβ(B类)和不溶物125I-Aβ组分(C类)通过γ计数器收集和计数。每个分数表示为总百分比125I-Aβ（每组各分数的总和）。*或#表示与对照MDM组（第1列）或具有活化T细胞的MDM（第2列）相比，p<0.05，由ANOVA和Newman-Keuls事后分析确定。
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