In vivo reconstitution of autophagy in Saccharomyces cerevisiae

doi:10.1083/jcb.200801035

.2008年8月25日；182(4):703-13.

doi:10.1083/jcb.200801035。

酿酒酵母自噬的体内重建

杨曹¹, Heesun Cheong先生, 宋慧, 丹尼尔·克林斯基

附属公司

PMID： 18725539
预防性维修识别码：项目经理2518709
内政部： 10.1083/jcb.200801035

酿酒酵母自噬的体内重建

杨曹等。 J细胞生物学. 2008.

.2008年8月25日；182（4）：703-13。

doi:10.1083/jcb.200801035。

作者

杨曹¹, Heesun Cheong先生, 宋慧, 丹尼尔·克林斯基

附属

¹密歇根大学生命科学研究所生物化学系，美国密歇根州安阿伯48109。

PMID： 18725539
预防性维修识别码：项目经理2518709
内政部： 10.1083/jcb.200801035

摘要

自噬是一种主要的细胞内降解途径，与各种人类疾病有关。然而，自噬的作用是复杂的；尽管该过程通常被认为具有细胞保护作用，但它也可能导致细胞功能障碍和疾病进展。我们对自噬的理解取得了很大进展，这在很大程度上得益于自噬相关（ATG）基因的鉴定。尽管如此，我们对分子机制的理解仍然有限。在本研究中，我们产生了一株删除了24个ATG基因的酿酒酵母多重敲除菌株，并用它进行了自噬途径的体内重建。我们确定了自噬不同方面的最低要求，并研究了吞噬细胞组装位置的初始蛋白质组装步骤。体内重建能够在控制这一过程的复杂调控网络的背景下研究自噬，这是体外系统无法进行的分析。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**MKO菌株的产生和性质。**（A） MKO策略的示意图。这个*loxP–Cre公司*该系统允许使用不同标记破坏多达五个基因，并通过Cre表达有效去除标记。多轮删除和标记物拯救产生了MKO菌株。有关详细信息，请参见材料和方法。（B） MKO菌株与野生型（WT）和*atg1Δ*菌株。重量，*atg1Δ*MKO菌株在YPD中培养过夜并稀释至OD₆₀₀= 0.1. OD去除等分试样₆₀₀每小时读数13小时。（C）MKO菌株的形态。WT和*atg18Δ*菌株和带有或不带有表达Atg18质粒（pATG18（415））的MKO菌株在YPD中对数期生长，并通过显微镜观察。MKO菌株的液泡增大，类似于*atg18Δ*应变；用Atg18转化后，液泡大小与野生型相同。棒材，2μm。（D）表达Atg6的MKO菌株在羧肽酶Y、MVB或碱性磷酸酶途径上没有缺陷，并通过Prc1、Cps1（未描述）和Pho8处理的脉冲相实验进行了分析。这个*atg6Δ*用表达Atg6的质粒（pATG6（414））或空pRS414载体转化的MKO菌株，按照材料和方法中的描述进行放射性标记/非放射性追踪和三重免疫沉淀，然后用8%SDS-PAGE进行分析。羧肽酶Y（Prc1）以前体（p1）形式通过内质网转运，在高尔基复合体中获得p2形式，并通过晚期内体-MVB途径传递到液泡并转化为成熟（m）形式。液泡碱性磷酸酶（Pho8）通过内质网上质网转运到高尔基体（p）但绕过内体，在液泡中被蛋白水解激活为成熟（m）形式。碱性磷酸酶途径不需要Atg6；然而，为了保持一致性，在整个实验中使用了表达Atg6的细胞。

**图2。**
**重组Cvt途径的货物识别和包装步骤。**（A） MKO中货物prApe1的本地化(*atg15ΔRFP-APE1*)MKO中受体Atg19和适配器Atg11的定位(*ape1Δatg15Δ*)应变。MKO公司(*atg15ΔRFP-APE1*)应变和MKO(*ape1Δatg15Δ*)用表达YFP-Atg19（pYFPATG19（416））或HA标记CFP-Atg11（pCuHACFPATG11（414））的质粒转化的菌株在选择性SMD培养基至中对数期生长，并通过荧光显微镜观察。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。（B） prApe1、Atg19和Atg11的染色。MKO公司(*atg15ΔRFP-APE1*)用表达YFP-Atg19、HA标记CFP-Atg11或两者的质粒转化该菌株，生长到中对数期，并通过荧光显微镜观察。当Atg19在MKO中与prApe1共存时(*atg15ΔRFP-APE1*)菌株，货物prApe1与受体Atg19共定位（顶部）。当Atg19不存在时，适配器Atg11（箭头）没有与货物（中间）协同定位。当prApe1、Atg19和Atg11都存在时，这三种蛋白质共定位到相同的结构（底部）。棒材，2.5μm。

**图3。**
**重建特定于匮乏的PAS组件的初始步骤。**（A） Atg17-GFP在野生型（WT）和MKO中的定位(*在17-GFP*)菌株。WT公司(*ATG17-GFP公司*)应变；MKO公司(*ATG17-GFP公司*)用载体（pRS415）、表达Atg1（pATG1（415））、Atg13（pATG13（415；和MKO(*ATG11 ATG17-GFP*)用表达Atg1或Atg13的质粒转化的菌株在选择性SMD培养基中生长到中对数期，然后转移到SD-N中饥饿2小时。从生长（中对数期）和饥饿条件下采集样品，用于荧光显微镜分析。生长和饥饿条件下，Atg17-GFP在WT细胞中均呈点状结构；有些细胞在饥饿状态下有多个点状突起。在MKO中(*ATG17-GFP公司*)菌株Atg17在两种条件下均为胞质；只有当Atg1和Atg13同时表达时，其定位模式才在饥饿状态下转变为点状结构。Atg1和Atg11的共表达或Atg13和Attg11不能将Atg17从胞浆重新分配到点状结构。显示了具有代表性的图像。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。（B） Atg17-GFP在MKO中的空泡周围定位(*ATG17-GFP公司*)应变。MKO公司(*ATG17-GFP公司*)用表达Atg1和Atg13的质粒转化的菌株（pATG1-Atg13（415））生长到中对数期，用材料和方法中描述的空泡染料FM 4–64染色，并在成像前转移到SD-N 2 h。当Atg1和Atg13同时表达时，Atg17-GFP点在饥饿条件下定位于空泡周围。棒材，2.5μm。（C）在营养（开放栏）和饥饿（封闭栏）条件下，对多种Atg蛋白组合共表达的MKO菌株（HCY107、HCY113和HCY151）中含有Atg17-GFP PAS点的细胞数量进行量化。对每个菌株的大约100–250个细胞进行分析，以对带有荧光PAS点的细胞百分比进行评分。

**图4。**
**重组Atg12–Atg5共轭体系。**MKO、MKO(*自动液位计3*)、和*atg12Δ*用各种质粒转化的细胞在选择性SMD培养基中生长，在中对数期收集，并使用抗HA抗体进行蛋白质印迹分析。0.2盎司₆₀₀在每条车道上装载单元单元。Pgk1被用作加载控制。表达HA标记Atg12的质粒（pHA-Atg12（416））；附件7和附件10（pATG7-Atg10（414））；Atg5和HA标记的Atg12（pATG5-HA-Atg12（416））；Atg5、HA-Atg12和Atg16（pATG5-HA-Atg12-Atg16（416））；如图所示，使用Atg8、Atg4、Atg7和Atg10（pATG8-Atg4-Atg7-Atg10（414））。随着Atg5、Atg12、Atg7和Atg10在MKO菌株中表达，少量Atg12–Atg5共轭物形成（车道5）。Atg16的额外表达提高了共轭效率（车道6）。来自Atg8共轭体系的Atg8、Atg4和Atg3的存在进一步促进了Atg12–Atg5的形成和/或增强了其稳定性（车道7和8）。

**图5。**
**重组Atg8–PE共轭体系。**（A） Atg4和Atg12-Atg5共轭系统在Atg8-PE形成中的作用。MKO公司(*自动液位计3*)用不同质粒组合转化的细胞在选择性SMD培养基中生长，在中对数期或饥饿后2h收集，然后用抗Atg8抗血清进行Western blot分析。0.2外径₆₀₀在每条车道上装载单元单元。Pgk1被用作加载控制。表达Atg8的质粒（pATG8（414））；附件8、附件4、附件7和附件10（pATG8-Atg4-Atg7-Atg10（414））；Atg5、HA-Atg12和Atg16（pATG5-HA-Atg12-Atg16（416））；如图所示，使用了Atg8ΔR、Atg7和Atg10（pATG8ΔR-Atg7-Atg10（414））。即使表达了Atg8–PE和Atg12–Atg5共轭系统中的所有已知成分（通道4），在生长和饥饿条件下也几乎未检测到Atg8-PE。然而，当表达Atg8ΔR且不表达Atg4时，观察到大量的Atg8–PE（第5条车道），并且当Atg12–Atg5共轭系统的所有成分也表达时，数量进一步增加（第6条车道）。请注意，Atg8–PE在SDS-PAGE期间异常迁移，并低于Atg8。（B） Atg12–Atg5共轭系统在Atg8–PE形成中的作用。实验程序与表达Atg8ΔR（pATG8ΔR414）的A.质粒相同；Atg8ΔR、Atg4、Atg7和Atg10（pATG8ΔR-Atg4-Atg7-Atg10（414））；Atg8ΔR、Atg7和Atg10；附件5（pATG5（416））；HA标记的Atg12（pHA-Atg12（416））；附件16（pATG16（416））；Atg5和HA-Atg12（pATG5-HA-Atg12（416））；如图所示，使用Atg5、HA-Atg12和Atg16。这个*atg4Δatg8Δ*用表达Atg8ΔR（pATG8ΔR414）的质粒转化的菌株*pep4Δ*菌株被用作对照（泳道10和11）。当Atg4存在时，未检测到Atg8–PE频带（比较通道3和4）。仅表达Atg5、Atg12或Atg16并不能改善Atg8-PE形成（将车道5-7与车道4进行比较）。当通过表达Atg7、Atg10、Atg12和Atg5形成Atg12–Atg5共轭物时，Atg8–PE形成的效率大大提高（车道8）。Atg16进一步促进了Atg8–PE共轭和/或增强了共轭的稳定性（车道9）。

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