Targeting Bcl-2-IP3 receptor interaction to reverse Bcl-2's inhibition of apoptotic calcium signals

doi:10.1016/j.molcel.2008.06.014

.2008年7月25日；31(2):255-65.

doi:10.1016/j.molcel.2008.06.014。

靶向Bcl-2-IP3受体相互作用逆转Bcl-2对凋亡钙信号的抑制

伊平荣¹, Ademuywa S阿罗莫拉兰, Geert Bultynck公司, 费忠, 向丽, 凯伦·麦克尔, 松山喜吉, 斯蒂芬·赫利茨, H卢埃林·罗德里克, 马丁·D·布特曼, 格雷戈里是一个强者, 1月B日聚会, 亨伯特·德·斯梅特, 克拉克·W·迪斯特霍斯特

附属公司

PMID： 18657507
预防性维修识别码： PMC3660092
DOI（操作界面）： 2016年10月10日/j.molcel.2008.06.014

靶向Bcl-IP3受体相互作用逆转Bcl-2对凋亡钙信号的抑制作用

伊平荣等。分子电池. 2008.

.2008年7月25日；31(2):255-65.

doi:10.1016/j.molcel.2008.06.014。

作者

伊平荣¹, Ademuyiwa S Aromolaran公司, Geert Bultynck公司, 费忠, 向丽, 凯伦·麦克尔, 松山喜吉, 斯蒂芬·赫利茨, H卢埃林·罗德里克, 马丁·D·布特曼, 格雷戈里是一个强者, 1月B日聚会, 亨伯特·德·斯梅特, 克拉克·W·迪斯特霍斯特

附属

¹美国俄亥俄州克利夫兰凯斯西储大学医学系，44106。

PMID： 18657507
预防性维修识别码： PMC3660092
DOI（操作界面）： 2016年10月10日/j.molcel.2008.06.014

摘要

抗凋亡蛋白Bcl-2抑制内质网（ER）释放Ca2+。一种提出的机制涉及Bcl-2与内质网上定位于Bcl-2的肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP3R）Ca2+通道的相互作用。在这里，我们通过FRET记录了细胞内Bcl-2-IP3R的相互作用，并确定了IP3R调控和耦合域中的Bcl-2相互作用区域。基于该IP3R序列的肽取代了IP3R中的Bcl-2，并在体外逆转了Bcl-2介导的对IP3R通道活性的抑制，IP3诱导渗透细胞中的ER Ca2+释放，以及细胞可渗透IP3酯类诱导完整细胞中的Ca2+升高。该肽还逆转了Bcl-2对T细胞受体诱导的Ca2+升高和凋亡的抑制作用。因此，Bcl-2与IP3R的相互作用有助于Bcl-2调节促凋亡Ca2+信号，表明Bcl-2-IP3R相互作用是与Bcl-2抑制细胞死亡相关疾病的潜在治疗靶点。

PubMed免责声明

数字

**图1。Bcl-2-IP3R相互作用的FRET检测**
在表达CFP-Bcl-2+YFP-IP3R和CFP-YFP cameeon的COS-7细胞中，通过YFP漂白后CFP荧光增强检测到FRET，但不控制荧光标记蛋白的组合。（A） YFP光漂白前后CFP荧光强度的代表性图像（左栏和中栏）。灰度值图像（右栏）是通过从漂白后图像中逐像素减去CFP预漂白图像得到的，相对强度差异用灰度表示。比例尺，5μm。（B） Bcl-2和IP3R上CFP和YFP的C端子位置图。（C）在三个单独的实验中，从CFP和YFP共定位区域中随机选择多个感兴趣区域（每对样品>60）。利用Volocity软件根据CFP排放量的增加计算FRET效率。符号表示平均值±SEM。*p<0.01。

**图2。内源性Bcl-2抑制抗CD3诱导的钙²⁺Jurkat单元中的高程**
（A）免疫印迹法检测野生型WEHI7.2、Jurkat和Bcl-2（+）WEHI7.2细胞中的Bcl-2水平。（B） Jurkat提取物中Bcl-2与IP3R的免疫共沉淀；使用抗Bcl-2抗体进行免疫印迹分析。（C）用非靶向对照siRNA（siNT）或Bcl-2 siRNA（siBcl-2）转染24和48小时后，Jurkat提取物中Bcl-2的免疫印迹。（D）数字成像轨迹（每个样本平均160个细胞）监测钙²⁺细胞外钙存在下20μg/ml抗CD3诱导的升高²⁺.（E）峰值Ca²⁺20μg/ml抗CD3在细胞外Ca存在下诱导的升高²⁺（平均值±SEM，三个实验）。（F）峰值Ca²⁺100 nM thapsigargin诱导的升高，在缺乏细胞外钙的情况下进行荧光测量²⁺（平均值±SEM，三个实验）。（G）胞浆Ca下面积²⁺340 nM/380 nM比值曲线（F）（平均值±SEM，三个实验）。

**图3。Bcl-2-IP3R交互映射**
（A）类型1 IP3R域图。（B和C）GST-IP3R片段下拉，使用来自Bcl-2（+）WEHI7.2或Jurkat细胞的细胞溶质提取物作为Bcl-2来源。（上面板）考马斯蓝染色凝胶，显示输入GST-IP3R片段；（底部面板）免疫印迹法检测Bcl-2。代表使用Bcl-2（+）WEHI7.2提取物的五个实验和使用Jurkat提取物的两个实验的结果表明，Bcl-2主要与结构域3相互作用。（D）在三种不同的缓冲液中制备Bcl-2（+）WEHI7.2细胞的细胞提取物，这三种缓冲液主要因洗涤剂类型和浓度而异。在GST-IP3R下拉和清洗步骤中使用了相同的缓冲液，但在缓冲液2中和缓冲液3中添加了1%的BSA，并且在结合步骤中将NaCl浓度增加到300 mM，以提高结合特异性。此外，清洗步骤用缓冲液1重复三次，但用缓冲液2和3重复七到八次。（上面板）GST-IP3R片段的考马斯蓝染色，重复两次，结果相同。（E） GST下拉，如（B）所示，使用GSTIP3R子域片段3a、3b、3a1和3a2。（上面板）记录IP3R片段输入水平的抗-GST免疫印迹。（下图）抗Bcl-2免疫印迹，证明亚结构域3a1是Bcl-2在IP3R上的主要结合区。这个实验重复了两次，结果相同。（F）表明His-tagged Bcl-2纯度的银染凝胶。（G） GST下拉，带有纯化的His-tagged Bcl-2。（上面板）输入经SDS-PAGE解析并用考马斯蓝染色的GST-IP3R片段。（底部面板）Bcl-2免疫印迹显示纯化的30kDa His-Bcl-2直接与GST-IP3R结构域3相互作用，重复三次，结果相同。

**图4。IP3R肽抑制Bcl-2-IP3R相互作用但不抑制Bim-Bcl-2相互作用**
（A）肽1和2的序列，对应于IP3R亚结构域3a1内的区域，以及代表肽2的混乱序列的控制肽。（B）在GST下拉分析中，肽2抑制Bcl-2和GST-IP3R结构域3之间的相互作用。将Bcl-2（+）WEHI7.2细胞提取物与200μM或1 mM肽预孵育20 min，然后添加带有GST-IP3R结构域3片段的谷胱甘肽sepharose树脂。（C和E）IP3R在400μM肽存在下从Bcl-2（+）WEHI7.2细胞（C）或Jurkat细胞（E）的提取物中免疫沉淀。肽2，而不是肽1或对照肽，抑制Bcl-2-IP3R共免疫沉淀。（D）三个GST下拉实验中Bcl-2免疫印迹信号强度的总结与（C）相同（平均值±SEM）。（F）在400μM多肽存在下，从Bcl-2（+）WEHI7.2细胞提取物中免疫沉淀Bcl-2，并通过抗Bim免疫印迹检测Bim的共免疫沉淀。控制肽和肽2均不干扰Bcl-2-Bim相互作用。（G）三个实验中的Bim免疫印迹信号强度总结与（F）相同（平均值±SEM）。

**图5。肽2逆转Bcl-2对IP3R通道开放的抑制作用**
（A）具有250 nM Ca的平面脂质双层在0 mV下的IP3R 1型单通道记录²⁺和2μM IP3顺式（细胞溶质）室（标记为零电流水平）。底部面板中显示了扩展时间刻度的电流记录道。纯化的Bcl-2（0.1μM），添加到顺式隔间，通道活动受阻。随后添加肽2（10μM）逆转了Bcl-2对通道活性的抑制。（B）所示为单通道记录，记录添加Bcl-2后不到3分钟内检测到通道活性显著降低。（C）测量Bcl-2和肽对IP3R通道开放概率影响的多项实验（平均值±SEM）总结。n=检查的单个通道数量。符号表示平均值±SEM。*p<0.05。

**图6。肽2逆转Bcl-2对抗CD3诱导钙的抑制作用²⁺高程**
（A）代表性Ca²⁺记录抗CD3（箭头，添加时间）诱导Ca的示踪（每个为−65细胞的平均值）²⁺Bcl-2（+）WEHI7.2细胞升高。Chariot试剂促进了肽（60μM）的摄取。（B）抗CD3诱导的Ca峰值²⁺用（A）中的肽处理的Bcl-2（−）和Bcl-2。（C）代表性Ca²⁺Jurkat细胞中的痕迹（平均每个细胞85个）。处理条件与（A）中相同，只是添加了一个涉及添加肽2而不添加Chariot试剂的对照。（D）抗CD3诱导Ca峰值²⁺如（C）中用肽处理的Jurkat细胞中的升高（平均值±SEM，七个实验，每个实验每个样品平均81个细胞）。

**图7。肽2增强Bcl-2阳性细胞中抗CD3诱导的细胞凋亡**
（A） 5μg/ml抗CD3治疗Jurkat细胞24小时后典型的凋亡核形态（箭头，Hoechst 33342染色）。比例尺，10μm。（B）将Bcl-2（−）和Bcl-2。（C） Jurkat细胞预先孵育±60μM肽±Chariot试剂，然后与5μg/ml抗CD3孵育24小时。符号表示五个实验中具有凋亡细胞核的细胞百分比（平均值±SEM）（每份盖玻片计240个细胞）。

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