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。2008年7月2日；28(27):7013-23.
doi:10.1523/JNEUROSCI.1673-08.2008。

自发网络活动期间，反向传播动作电位触发BDNF的树突状释放

尼古拉·库奇夫斯基 1, 克里斯托夫·波切, 纳丁·费兰德, 埃尔维·佛罗伦萨, 克里斯托夫·佩莱格里诺, 理查德·科拉罗, 沃尔克马尔·莱斯曼, 伊戈尔·麦地那, Jean-Luc Gaiarsa女士
附属公司

自发网络活动期间，反向传播动作电位触发BDNF的树突状释放

尼古拉·库奇夫斯基等。 神经科学。 。

摘要

脑源性神经营养因子（BDNF）是活动依赖性突触发育和可塑性的主要调节因子。由于BDNF是一种分泌蛋白，有人提出BDNF以活动依赖性的方式从靶神经元释放。然而，目前尚缺乏直接证据证明持续网络活动触发的BDNF突触后释放。在这里，我们用绿色荧光蛋白（GFP）标记的BDNF转染分离的海马神经元培养物，并结合全细胞记录、延时荧光成像和免疫染色来监测BDNF的活性依赖性树突状释放。我们发现自发的反向传播动作电位，而不仅仅是突触活动，导致了BDNF-GFP的Ca2+依赖性树突状释放。此外，我们提供证据表明，从单个神经元释放的内源性BDNF可以磷酸化邻近神经元中的CREB（cAMP反应元件结合蛋白），这是立即早期基因激活的重要步骤。因此，我们的研究结果支持了BDNF可能作为活动依赖性突触可塑性和发育的靶向信使的假设。

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数字

图1。
图1。
自发的网络活动触发BDNF-GFP发布。a–f重叠图像显示在非渗透条件下使用抗GFP抗体（红色）检测到的细胞内GFP荧光（绿色）和分泌的BDNF-GFP。一，海马神经元仅转染GFP。b–f，转染BDNF-GFP的神经元。b条，控制条件。c（c），在TTX（1μ米).天，用4-AP（50μ米).e（电子），用4-AP（50μ米)在NBQX（5μ米),天-APV（40μ米)和荷包牡丹碱（10μ米)，在图中表示为“antago”（f），用4-AP（50μ米)在NBQX在场的情况下，天-APV、荷包牡丹碱和TTX（1μ米). 上图，用BDNF-GFP构建物（绿色）转染的神经元荧光通道和用GFP抗体进行免疫细胞化学染色（红色）的合并图片。底部，转染神经元表面结合BDNF-GFP的定量（黄色信号）；这些图是平均灰度值的三维表示。克，在不同ACSF条件下比较BDNF-GFP转染的神经元的表面结合GFP的定量分析(n个=4种不同的培养物，每个培养物中有4个神经元）。小时，不同条件下神经元的平均放电率，在细胞连接配置中测量(n个=每种情况下5个神经元）。对，每种情况的典型电生理痕迹。释放的BDNF-GFP产生的绿色信号在这里显示的图像中不可见，因为用于避免转染神经元中绿色信号饱和的低激光强度。未转染细胞中的红色信号可归因于转染神经元分泌的BDNF-GFP，其与邻近细胞的膜TrkB受体结合。Antago进入e（电子）,（f）、和小时代表NBQX（5μ米)，APV（40μ米)和荷包牡丹碱（10μ米). 控制中心。在本图和下图中，*表示第页与对照条件相比<0.05。
图2。
图2。
去极化步骤触发BDNF-GFP的树突状分泌。一在0.01Hz下，通过50–60mV去极化的20个去极化步骤（500ms长）降低了树突中BDNF-GFP颗粒的荧光强度。请注意，荧光在白色圆圈内减少，而在周围区域没有增加，这表明荧光强度的减少不是由于x–y-轴。左，DP的代表性痕迹；注意向内Ca2+去极化产生的电流。对，树突状BDNF-GFP颗粒（以圆圈表示）在DPs前后的示例。b条、DPs诱发树突状荧光变化的平均时间进程(n个= 11).c（c）,天，DP在仅转染GFP的神经元中未能产生显著的荧光变化(n个= 9).e（电子），镀镉可消除DPs对树突状荧光的影响2+(200 μ米;n个= 8); 注意钙的缺乏2+响应DP的电流（叠加控制和Cd2+记录道）。（f）GDPβ-S突触后负荷（0.6 m米)是一种阻止颗粒分泌的G蛋白抑制剂，可阻止DP-诱导的BDNF-GFP-转染细胞树突荧光降低(n个= 8); 注意Ca2+对DP的响应电流没有受到影响（叠加控制和Cd2+迹线）。所有实验均在NBQX和APV存在下进行。相对，相对。
图3。
图3。
表面染色证实了去极化步骤产生的BDNF-GFP分泌。表达BDNF-GFP的神经元接受通过记录移液管施加的20个阈值上或20个阈值下DP。细胞内溶液含有罗丹明，用于事后（post-hoc）识别。通过对GFP的免疫细胞化学染色，在非渗透条件下检测释放的BDNF-GFP的表面染色（蓝色染色）。
图4。
图4。
AP在培养神经元中的树突状反向传播。一，培养中神经元的成对体细胞和树突状细胞全细胞记录示例。b条体细胞电流注入诱发的AP反向增殖到树突中。c（c），胞体中产生的自发AP反向传播到树突中。注意体细胞和树突状AP之间的延迟。
图5。
图5。
突触驱动的b-AP通过膜去极化触发树突状BDNF分泌。一当神经元保持在−52±1 mV时，突触诱导的b-AP产生树突状BDNF-GFP分泌(n个= 5); 箭头指示第一个AP的到达。左，代表性痕迹。b条，当记录吸管中的QX314阻止AP时，BDNF-GFP不会分泌(n个= 9). 左，代表性痕迹。c（c），膜去极化至-40 mV，在移液管中使用QX314，即使在没有AP的情况下也会产生BDNF-GFP分泌(n个= 6). 左，代表性痕迹。相对，相对。
图6。
图6。
VDCC激活，但不激活细胞内Ca2+β-AP诱导的BDNF分泌需要储存。一，BDNF-GFP的分泌是由体细胞电流注入产生的放电活性诱导的。左图，台阶诱发放电活动的代表性痕迹(n个= 17).b条，通过浴敷VDCC阻滞剂CdCl（200μ米;n个= 9).c（c）、Thapsigargin（10μ米)未阻止b-AP引发的BDNF-GFP释放(n个= 8). 左图，台阶引发的燃烧活动的典型痕迹。箭头表示第一动作电位的到来。在a–c,五小时=−70 mV相对电压。
图7。
图7。
细胞内钙2+持续活动产生的BDNF分泌不需要储存。a–c，对照条件下神经元培养物的表面免疫荧光染色(一)并在TTX中孵化(b条)或thapsigargin（10μ米;c（c）)持续3小时。天，不同条件下表面结合GFP（黄色信号/绿色信号）的定量分析(n个=3个培养物，每个培养物中有4个神经元）。Thapsi和Thapsigargin。
图8。
图8。
BDNF-GFP释放的概率随着AP数量的增加而增加。诱导树突状BDNF-GFP分泌的概率（刺激后100到200秒之间荧光减少>3%）是体细胞电流注射诱发的AP数量的函数（3.96±0.5 Hz）。插图，AP的代表性痕迹。括号中是实验次数。
图9。
图9。
内源性BDNF通过放电活动释放。显示了电生理刺激后未转染神经元细胞中pCREB的激活。左和中，pCREB（左）和MAP2（中）的图像，位于修补后的罗丹明填充细胞附近的神经元中（箭头所示）。右，相同视野下，MAP2和pCREB免疫染色（蓝色）存在下罗丹明填充细胞免疫荧光（红色）的合并图片。比例尺，45μm。a–c、控制条件；细胞有补丁，但没有受到刺激。d–f日，细胞被打补丁并被刺激激发（在10赫兹下40个尖峰）。g–i类，在BDNF清除剂TrkB IgG的存在下，细胞修补并激发（10 Hz下40个峰值）。j个，通过测量荧光强度显示pCREB水平激活的直方图（平均灰度值）(n个=每种情况下有3种培养物。pCREB的量通过距离记录的神经元250μm计算得出。共有47、56和49个神经元分别用于分析控制、刺激和TrkB-IgG条件下pCREB的强度）。对补充NBQX和APV的ACSF进行电生理学检查。刺激，刺激。
图10。
图10。
单细胞刺激后pCREB阳性神经元的分布。一电流钳中神经元刺激产生的CREB磷酸化（10 Hz下40个峰值）分布在培养物中，可以在离受刺激细胞较远的地方观察到。b条在TTX存在的情况下，电压钳中神经元刺激产生的CREB磷酸化（50 mV的20 DP，0.1 Hz）仅限于受刺激细胞周围的神经元。正方形在高倍镜下显示细胞核。
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