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.2008年7月；10(7):776-87.
doi:10.1038/ncb1740。 Epub 2008年6月15日。

Beclin1-binding UVRAG以C类Vps复合物为靶点，协调自噬体成熟和内吞运输

华裔科学家梁澄玉 1, 李宗洙, 京秀酒店, 迈克尔·盖克, 李庆林, 埃斯特班·罗伯茨, 伊莎贝尔·弗涅, 德雷蒂奇, 冯平慧, 赤泽千寻, Jae U Jung先生
附属公司

Beclin1-binding UVRAG以C类Vps复合物为靶点，协调自噬体成熟和内吞运输

华裔科学家梁澄玉等。 Nat细胞生物学. 2008年7月.

摘要

自噬和内吞途径是严格调控的膜重排过程，对体内平衡、发育和疾病至关重要。自噬性货物从自噬体传递到溶酶体，通过一个复杂的过程进行降解，该过程在拓扑上类似于内体成熟。在这里，我们报道了一种Beclin1结合的自噬肿瘤抑制因子，UVRAG，与C类Vps复合体相互作用，C类Vp复合体是细胞内融合机制的关键组成部分。这种相互作用刺激Rab7 GTPase活性和自噬体与晚期内体/溶酶体的融合，从而增强自噬货物的传递和降解。此外，UVRAG-C-Vps类复合物加速内吞体-内吞体融合，导致内吞物快速降解。值得注意的是，由UVRAG-C-Vps类复合物介导的自噬体/内体成熟与UVRAG-Beclin1介导的自噬体形成在遗传上是可分离的。这一结果表明，UVRAG作为多价转运效应器发挥作用，不仅调节自噬的两个重要步骤——自噬小体的形成和成熟，还调节内吞融合，同时促进自噬和内吞货物运输到降解室。

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数字

图1
图1。UVRAG与C-Vps的相互作用和共定域
(一)UVRAG与C-Vps的相互作用。293T细胞联合转染Flag–UVRAG和HA–Vps16、HA–Vps 11、HA–V ps18、HA–vps 33或HA–Vp 39。全细胞裂解物（WCL）用于免疫沉淀（IP）和抗Flag抗体，然后免疫印迹（IB）和抗HA抗体。1%WCL用作输入。(b条)内源性UVRAG和C-Vps亚单位之间的相互作用。将293T细胞的WCL与对照血清（对照）或抗UVRAG抗体一起用于IP，然后使用指示抗体进行IB。右图显示了内源性蛋白质的表达。(c（c）)HeLa细胞内源性UVRAG与Vps16或Vps18共定位的共焦显微镜分析。插图突出显示了协同本地化。(d日)共焦显微镜分析了转染Flag–UVRAG和表位标记的C-Vps亚基的HeLa细胞中UVRAG-与C-Vps亚基的共定位。(e（电子）)早期内体中UVRAG–C-Vps的结肠化。用EGFP–Vps16和Flag–UVRAG联合转染HeLa细胞，用LAMP1、LAMP2、EEA1和Rab5抗体染色，然后用共焦显微镜观察。所有图像都代表了至少三个独立实验。比例尺，5μm。的原始数据一和b条如补充信息图S6所示
图2
图2。UVRAG的Vps16结合域的定位
(一)UVRAG的N端C2结构域或C端区域分别与Vps16相互作用。293T细胞与HA–Vps16以及载体Flag–UVRAG或Flag-UVRAG-突变体共同转染。WCL用抗Flag免疫沉淀，然后用抗HA抗体免疫印迹。(b条)如图所示，用EGFP–Vps16和Flag–UVRAG突变体转染HeLa细胞，并用抗Flag（红色）染色，然后用共聚焦显微镜进行染色。比例尺，5μm。(c（c）)UVRAG C末端截断突变体与Vps16的相互作用。在用HA–Vps16和Flag–UVRAG C末端突变体转染后48小时，293T WCL用抗Flag免疫沉淀，然后用抗HA免疫印迹。(d日)UVRAG C2结构域或C末端区域的缺失消除了Vps16的结合。在用HA–Vps16和Flag–UVRAG或其突变体转染后48小时，用抗Flag免疫沉淀293T WCL，然后用抗HA抗体免疫印迹。(e（电子）)UVRAG及其缺失突变体的示意图。++，强绑定；+，弱结合；−，无约束。的原始数据一,c（c）和d日如补充信息图S6所示
图3
图3。UVRAG向GFP–LC3标记的自噬体招募C-Vps蛋白
(一)赫拉。Vec和HeLa。用2μM雷帕霉素处理转染HA–Vps16和GFP–LC3的UVRAG细胞2 h，并进行共聚焦显微镜检查（左侧面板；标尺，5μM）。对HA–Vps16染色的GFP–LC3点状阳性百分比进行量化（右侧面板；数据为平均值±标准差。，n个＝60*P（P）< 0.01). (b条)Vps16对UVRAG介导的自噬体形成的影响。HeLa自噬体的光学显微镜定量。Vec和HeLa。UVRAG细胞（左上面板）或HCT116.Vec和HCT116.UVRAG-细胞（左下面板），当转染GFP–LC3和对照siRNA或电压16siRNA（数据为平均值±标准误差。，n个=60（对于HeLa电池）；n个HCT116电池=450*P（P）< 0.01; **P（P）< 0.001). 右侧面板显示了Vps16和微管蛋白的免疫印迹。
图4
图4。表达UVRAG的HeLa细胞自噬体成熟
(一)UVRAG增强了GFP–LC3与LAMP1的共定位效率。赫拉。Vec和HeLa。在不存在或存在巴非霉素A的情况下，用GFP–LC3转染的UVRAG细胞未经处理或用雷帕霉素（2μM）处理1（0.1μM），并对LAMP1进行染色。插图突出了同位化。在每个设置中计算LAMP1阳性自噬体的百分比（数据为平均值±标准偏差。，n个= 200; 5个独立实验**P（P）< 0.01; *P（P）< 0.05). (b条)UVRAG增强自噬体对CD63的获取。GFP–LC3转染HeLa。Vec和HeLa。UVRAG细胞按照一并对CD63进行染色，计算CD63阳性自噬体的百分比（数据为平均值±标准差。，n个= 200, **P（P）< 0.01; *P（P）< 0.05). (c（c）)UVRAG促进长寿命蛋白质的自噬降解。赫拉。Vec和HeLa。UVRAG细胞与我-三H-Leu（1μCi ml−1). 在指示的时间点，在完全培养基（NC）、EBSS单独培养基（Starv.）或EBSS+0.1μM巴非霉素A1（Starv.+BalfA1）中测量长寿命蛋白质的降解。结果（数据为三倍平均值±标准偏差）代表了两个独立实验。比例尺，5μm。
图5
图5。UVRAG介导的自噬体成熟依赖于C-Vps，而非Beclin1
(一)GFP–LC3和LAMP1的彩色化。表达野生型或突变型UVRAG的HeLa细胞转染GFP–LC3，并在正常条件下培养或用雷帕霉素（2μM）处理。LAMP与自噬体融合+通过共焦显微镜分析结构（左面板；雷帕霉素处理）并量化（右上面板；数据为平均值±标准电镜。，n个= 100). 箭头和插图显示了LAMP1+自噬体。使用荧光显微镜计算每个细胞中GFP–LC3阳性点的数量（右下面板；数据为平均值±标准偏差。，n个= 60, *P（P）< 0.05; **P（P）< 0.0001). (b条)电压16或电压18敲除抑制UVRAG介导的自噬体成熟。赫拉。Vec（左）和HeLa。用GFP–LC3和对照siRNA转染UVRAG（右）细胞，电压16siRNA，或电压18siRNA，然后是共焦显微镜。顶部面板中的箭头表示LAMP1染色的自噬体。中间面板显示了Vps16或Vps18和微管蛋白的免疫印迹。LAMP1的百分比+计算自噬体（数据为平均值±标准差。，n个= 50, *P（P）< 0.05). 比例尺，5μm。免疫印迹的原始数据如补充信息图S6所示。
图6
图6。UVRAG获取和激活Rab7
(一)UVRAG表达促进Rab7 GTPase向自噬体募集。赫拉。Vec和HeLa。转染GFP–Rab7和RFP–LC3的UVRAG细胞在正常条件下（NC）或用雷帕霉素处理，然后进行共聚焦显微镜观察。插图突出了Rab7对自噬体的获取。Rab7的百分比+-自噬体被定量（右面板；数据为平均值±标准差。，n个= 60, ***P（P）< 0.001; **P（P）< 0.01). 比例尺，5μm。(b条)Rab7 GTPase活性随着UVRAG的表达而增加。在转染GFP–Rab7和载体、UVRAG或UFRAG后48小时ΔN（1-147）使用载体293T WCL进行抗GFP免疫沉淀，然后进行Rab7 GTPase活性测定。左面板：通过TLC分析的GTP水解产物的放射自显影。右侧面板：Rab7水解GTP百分比的量化（数据为平均值n个=2个独立实验）。(c（c）)表达增强的Rab7–RILP相互作用UVRAG。HCT116.载体、HCT116.UVRAG和HCT116.UVRAGΔN（1-147）用GFP–Rab7和GST标记的RILP的Rab7结合域（GST–RILP）转染细胞RBD公司，残基243-318）。WCL用于GST下拉，然后用抗GFP抗体进行免疫印迹。免疫印迹的原始数据如补充信息图S6所示。
图7
图7。UVRAG促进内吞贩运
(一)EGF刺激的内吞和内吞后贩运。HCT116摄取Alexa Fluor 488–EGF（绿色）。Vec（左面板）和HCT116.UVRAG（右面板）细胞随后通过共焦显微镜观察。在指定的时间，细胞被固定并用LAMP1（红色）和Topro-3（蓝色）抗体染色以染色细胞核。插图的放大图像（第四行）突出了EGF向LAMP1阳性结构的转移。(b条)EGFR降解。HCT116.Vec、HCT116.UVRAG和HCT116.UVRAGΔN（1-147）用EGF（200 ng ml）处理细胞−1)在37°C下持续指定时间。WCL用抗EGFR抗体进行免疫印迹。对每个时间点的EGFR进行量化，并将其表示为相对于时间零点的EGFR的百分比（右侧面板；数据为平均值±s.e.m。，n个= 3). (c（c）)DQ-绿色BSA去淬试验。表达空载体（RAW264.7.Vec；黑色虚线）、野生型UVRAG（红线）或UVRAG的RAW264.7细胞的DQ-BSA蛋白水解的代表性共焦显微镜图像（左图）和流式细胞术分析（右图）ΔN（1-147）负载10μg ml的突变体（绿线）−1DQ绿色–指定时间的BSA。背景（灰线）表示没有BSA负载的样本。(d日)UVRAG对内体融合的影响。RAW264.7.Vec和RAW2647.UVRAG细胞用俄勒冈州绿514-亲和素和右旋糖酐-568脉冲标记10分钟并追踪30分钟。然后用生物素-BSA标记细胞10分钟，并进行共聚焦显微镜检查（左面板）。在缺乏生物素-BSA的情况下，俄勒冈州绿514亲和素显示出非常低的荧光（共聚焦图像的第一行）。在两个独立的实验中，从大约20个不同的细胞中计算了带有可见俄勒冈州绿色染色的右旋糖酐-568标记的内体的百分比（在左面板中用箭头表示）（平均值，右面板）。比例尺，5μm。b中免疫印迹的原始数据如补充信息所示，图S6。
图8
图8
UVRAG作为自噬体和内吞体机制协调器的作用模型。在自噬早期，UVRAG以Beclin1为靶点，促进自噬体的形成，而在后期，UVRAG与C-Vps相互作用，促进自吞噬体的成熟。UVRAG–C-Vps还通过激活Rab7参与内体-溶酶体转换。
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中的注释

  • UVRAG揭示了它的第二本质。
    Peplowska K、Cabrera M、Ungermann C。 Peplowska K等人。 自然细胞生物学。2008年7月；10(7):759-61. doi:10.1038/ncb0708-759。 自然细胞生物学。2008 PMID：18591968

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