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.2008年11月；217(2):319-27.
doi:10.1002/jcp.21503。

糖尿病小鼠HIF-1α表达的年龄依赖性损伤：电穿孔辅助基因治疗的纠正可增加伤口愈合、血管生成和循环血管生成细胞

刘立新 1, 盖伊·P·马蒂, 魏晓飞, 张贤杰, 张华峰, 叶五柳, 曼努埃尔·纳斯塔, 格雷格·塞门扎, 约翰·W·哈蒙
附属公司

糖尿病小鼠HIF-1α表达的年龄依赖性损伤：电穿孔辅助基因治疗的纠正可增加伤口愈合、血管生成和循环血管生成细胞

刘立新等。 J细胞生理学. 2008年11月.

摘要

老年糖尿病患者的伤口愈合受损。我们假设db/db糖尿病小鼠皮肤伤口愈合的年龄依赖性损伤：（a）与转录因子低氧诱导因子1alpha（HIF-1α）及其下游靶基因的表达降低相关；和（b）可以通过HIF-1α替代治疗来克服。对未经治疗或接受电穿孔促进HIF-1α基因治疗的db/db小鼠的伤口闭合、血管生成和兴奋性皮肤伤口中的mRNA表达进行分析，并对循环血管生成细胞（CACs）进行量化。与年轻（1.5-2个月）db/db小鼠相比，年龄较大（4-6个月）的小鼠伤口组织中HIF-1αmRNA水平显著降低。在老年db/db小鼠的伤口中，编码血管生成细胞因子血管内皮生长因子（VEGF）、血管生成素1（ANGPT1）、ANGPT2、血小板衍生生长因子B（PDGF-B）和胎盘生长因子（PLGF）的mRNA的表达也受到损害。皮内注射质粒gWIZ-CA5，该质粒编码HIF-1α的组成活性形式，随后进行电穿孔，在第3天诱导注射部位HIF-1 alpha mRNA水平升高，在第7天诱导VEGF、PLGF、PDGF-B和ANGPT2 mRNA的水平升高。经gWIZ-CA5治疗的小鼠外周血CACs增加10倍。与使用空载体治疗的小鼠相比，使用gWIZ-CA5治疗的db/db小鼠的伤口闭合速度显著加快。因此，HIF-1α基因治疗可以纠正HIF-1β表达、血管生成细胞因子表达和CACs的年龄依赖性损伤，这些损伤导致db/db小鼠伤口愈合的年龄依赖损伤。

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数字

图1
图1
创伤愈合特征分贝/分贝老鼠。A： 2月龄糖尿病小鼠的兴奋性伤口闭合(分贝/分贝)以及它们的杂合同窝配偶(数据库/+). 条形图显示了第9天通过计算机辅助平面测量法测量的伤口面积（像素）（平均值±SEM，每组n=20）*P（P）<0.01，学生t检验。B： 年龄对创伤愈合的影响分贝/分贝老鼠。对于指定年龄的小鼠，条形图显示了第9天的伤口面积（平均值±SEM，每组n=20）*P（P）<0.01，学生t检验。
图2
图2
2月龄和6月龄创伤中HIF-1α和血管生成细胞因子mRNA的表达分贝/分贝老鼠。在第3天或第5天从正常皮肤（第0天）或伤口中提取总RNA，并通过qRT-PCR分析每个mRNA。A:HIF-1α。B： PLGF公司。C： PDGF-B.D：血管内皮生长因子。E： ANGPT1。F： 角度2*P（P）<0.01，用Tukey检验进行方差分析，每组n=3。
图3
图3
编码HIF-1αCA5的表达载体的比较。A： HIF-1αmRNA水平分析。用1µg pCEP4-CA5、gWIZ-CA5或空载体（EV）转染HEK-293T细胞。转染24小时后提取总RNA并用qRT-PCR进行分析。将结果归一化为未转染细胞的结果。B： HIF-1转录活性分析。HEK-293T细胞与对照报告基因pSV Renilla共转染，编码雷尼利亚荧光素酶；HIF-1依赖性报告子p2.1，编码萤火虫荧光素酶；和pCEP4-CA5、gWIZ-CA5或EV。24小时后收集细胞，萤火虫比率：雷尼利亚测定荧光素酶活性。将结果归一化为EV转染细胞的结果（平均值±SEM，每组3次独立转染）。
图4
图4
建立皮肤DNA传递的最佳电穿孔参数。A： 皮内注射50微克gWIZ-EV或gWIZ-luc（编码萤火虫荧光素酶）质粒DNA后24小时进行生物发光成像，然后进行电穿孔。B： 在注射gWIZ-luc质粒后24小时，使用3种不同的方案（每组8个），在无电穿孔（No EP）或电穿孔（EP）后24小时测定平均生物发光。
图5
图5
电穿孔促进gWIZ-CA5基因转导进入细胞后mRNA表达的分析分贝/分贝老鼠。在质粒DNA注射/电穿孔后的指定日子从小鼠皮肤中分离RNA，并通过qRT-PCR分析编码HIF-1α（A）和血管生成细胞因子（B）的mRNA。
图6
图6
电穿孔促进gWIZ-CA5或gWIZ-EV转导后1、3或7天外周血循环血管生成细胞（CAC）计数。收集2只小鼠的外周血，分离单核细胞。细胞在内皮生长因子存在下培养4天，并测定每200倍视野内内化DiI-标记的乙酰化LDL和结合FITC-标记的BS-1凝集素的细胞数量。显示了CAC的平均数量（±SEM；n=3个池）*P（P）<0.05，方差分析与Tukey检验。
图7
图7
伤口闭合分贝/分贝电穿孔后的小鼠有助于DNA转导。A： 在受伤并转染gWIZ-CA5（CA5）或gWIZ-EV（EV）后的指定日期测定开放伤口面积（以像素为单位）。显示了平均值±SEM（CA5的n=48；EV的n=20）*P（P）<0.05，方差分析与Tukey检验。B： 显示了CA5与EV转染后伤口愈合≥95%的百分比*P（P）<0.001，Mann-Whitney秩和检验。
图8
图8
血管生成的免疫组织化学分析。A： 在第7天采集用gWIZ-EV（EV）或gWIZ-CA5（CA5）电穿孔的伤口，用PECAM-1（CD31）抗体染色，并进行图像分析以捕获信号（红色）。B–C类:平均血管密度（每200倍视野的血管数量；B类)和船舶面积（占油田总面积的百分比；C类)确定（每组n=15）*P（P）<0.05，学生t检验。
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