Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice

doi:10.1038/nn.2118

.2008年6月；11(6):721-8.

doi:10.1038/nn.2118。 Epub 2008年5月4日。

转基因小鼠单神经元标记诱导型Cre介导的敲除

保罗·杨¹, 李秋, 王东青（Dongqing Wang）, 赵胜利, 詹姆斯·格茹斯, 冯国平

附属公司

PMID： 18454144
预防性维修识别码： PMC3062628型
内政部： 10.1038/nn.2118

转基因小鼠中诱导性Cre介导敲除的单神经元标记

保罗·杨等人。自然神经科学. 2008年6月.

.2008年6月；11(6):721-8.

doi:10.1038/nn.2118。 Epub 2008年5月4日。

作者

保罗·杨¹, 李秋, 王东青（Dongqing Wang）, 赵胜利, 詹姆斯·格茹斯, 冯国平

附属

¹美国北卡罗来纳州达勒姆研究大道杜克大学医学中心神经生物学系，邮编：27710。p.young@ucc.ie

PMID： 18454144
预防性维修识别码： PMC3062628型
内政部： 10.1038/nn.2118

摘要

为了便于对挤满数十亿细胞的哺乳动物神经系统中的神经元连接进行功能分析，我们开发了一种新技术，在小鼠荧光标记的单个神经元中使用可诱导的基因操作。我们的技术，用诱导性Cre介导敲除（SLICK）标记单个神经元，是通过在一小群神经元中共存一种药物诱导型Cre重组酶和一种荧光蛋白来实现的，从而将功能强大的Cre重组酶系统用于条件遗传操作，并将单个神经元的荧光标记用于成像。在这里，我们证明了使用SLICK在几种类型的神经元中进行有效的诱导型遗传操作。此外，我们应用SLICK来消除一小部分神经肌肉接头的突触传递。我们的结果为成年动物非活动性神经肌肉突触的长期稳定性提供了证据，并证明了一种用于分离单个可识别神经元中基因功能的Cre-loxP兼容系统。

PubMed免责声明

数字

**图1。在SLICK转基因小鼠中联合表达YFP和cre的策略**
**答：。**用于生成SLICK转基因小鼠的DNA构建的示意图。Thy1启动子的两个拷贝驱动YFP的表达和cre重组酶的诱导形式–creER^T2段CreER公司^T2段由cre重组酶融合到来自雌激素受体的修饰配体结合域组成，可被合成配体他莫昔芬激活，但不能被内源性雌激素激活。因此，三苯氧胺给药可用于控制重组的时间。**B、 C、。**使用SLICK系统实现条件基因敲除和表达的策略。SLICK小鼠首先与通过cre介导的重组控制感兴趣基因表达的小鼠杂交。对于基因敲除，感兴趣基因的部分或全部编码序列两侧有两个短的loxP序列（“floxed”），并在cre被三苯氧胺（B）激活后被切除。对于有条件的转基因表达，转录停止序列（stop盒）位于转基因编码序列的上游。通过激活的cre删除停止盒，启动转基因表达（C）。D类,**E.公司。**双荧光就地SLICK-V转基因小鼠SLICK-A皮层和海马YFP（绿色）和cre重组酶（红色）的杂交。比例尺=20μm。

**图2。SLICK转基因小鼠不同神经元群的YFP标记**
**答：。**SLICK-A线背阔肌运动轴突的标记（绿色）。神经肌肉接头（红色）处乙酰胆碱受体与α-银环蛇毒素的协同训练表明，在这条线上只有一部分运动轴突被标记。B。SLICK-a线中少数背根神经节（DRG）神经元表达YFP。**C、。**标记SLICK-3系小脑颗粒细胞层中苔藓纤维轴突和神经末梢的子集。**D、 E.公司。**SLICK-3小鼠嗅球中一小部分YFP表达的二尖瓣细胞。图E显示了两个肾小球二尖瓣细胞顶端树突的高倍视图。**F、。**SLICK-X线第五层皮层神经元的标记**G.公司。**明亮的YFP标记SLICK-V系小鼠视网膜中的少量视网膜神经节细胞。**H、我，J。**SLICK-V小鼠海马（H和I）和新皮质（J）锥体神经元的极稀疏标记。在高倍镜下，树突棘等精细形态特征很容易辨认（I）。比例尺=20μm。

**图3。SLICK转基因小鼠的遗传操作**
**答：。**R26R cre报告菌株的示意图。在cre介导的重组后，移除新霉素抗性基因和转录停止序列，以允许表达编码β-半乳糖苷酶的LacZ报告基因。黑色三角形代表loxP站点。将与R26R报告基因杂交的SLICK-V转基因小鼠用三苯氧胺诱导cre重组酶活性或用玉米油作为对照**.B-E型。**在三苯氧胺处理的小鼠（B、C、D）的荧光标记神经元中观察到Lac-Z表达所指示的有效遗传操纵，但在对照动物（E）中没有观察到。B。第五层皮层神经元。**C和E**海马CA1区的金字塔神经元。齿状回中的颗粒细胞。

**图4。通过以下途径抑制运动神经元亚群的神经传递*中国税务局*SLICK-A小鼠的基因敲除**
**答：。**条件的示意图*中国税务局*等位基因。外显子3和4在cre介导的重组后被删除。**B、 C、。**免疫荧光染色*ChAT输入*进入眼外肌的神经段。高效*中国税务局*在三苯氧胺处理的YFP标记的运动轴突（C）中观察到敲除，但在对照动物（B）中未观察到敲除了。箭头和箭头显示*中国税务局*⁺和*中国税务局*⁻轴突。**D、 E.公司。**NMJ染色*中国税务局*以及α-银环蛇毒素（用于标记乙酰胆碱受体）。所有神经末梢均表现强劲*中国税务局*对照动物的染色，但*ChAT是*在他莫昔芬治疗的动物中，从YFP标记的末端特别删除。箭头和箭头显示*中国税务局*⁺和*中国税务局*⁻NMJ。**F、 G、H。**NMJ形态方面的量化*中国税务局*⁺和*中国税务局*⁻NMJ。NMJ的长度被确定为F（n＝75个结）中的总结尺寸的度量。α-银环蛇毒素的染色强度被量化为G（n=40个连接）中连接乙酰胆碱受体密度的测量。YFP标记的NMJα-银环蛇毒素染色区域*中国税务局*⁻和*中国税务局*⁺突触前神经末梢，在H处测量（n=97个连接点）。所有量化中均使用了至少三块肌肉的数据。比例尺=20μm。F、G、H中的误差条表示平均值的标准误差。

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