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。2008年7月；19(7):2777-88.
doi:10.1091/mbc.e07-10-0995。 Epub 2008年4月16日。

钙连蛋白的亚细胞分布由PACS-2介导

内森·米希尔 1, Emily M Lynes女士, 贾拉尔·A·南吉, 布拉戈维申斯卡娅, 郝飞, 卡蒂娅·卡明·西蒙, 蒂莫西·库珀, 加里·托马斯, 托马斯·西蒙
附属公司

钙连蛋白的亚细胞分布由PACS-2介导

内森·米希尔等。 分子生物学细胞。 2008年7月。

摘要

Calnexin是一种内质网（ER）凝集素，可介导粗内质网上的蛋白质折叠。Calnexin还与定位于线粒体相关膜（MAM）的内质网钙泵相互作用。根据内质网内稳态，不同数量的calnexin靶向质膜。然而，迄今为止尚不清楚calnexin的调节分选机制。我们的结果现在描述了calnexin与细胞溶质分选蛋白PACS-2的相互作用是如何在粗面内质网、MAM和质膜之间分配calnexiin的。在控制条件下，80%以上的calnexin定位于内质网，大多数位于MAM上。PACS-2敲除破坏了内质网内calnexin的分布，并增加了其在细胞表面的水平。两种calnexin胞质丝氨酸（Ser554/564）的蛋白激酶CK2磷酸化降低了calnexiin与PACS-2的结合。与此一致，Ser554/564天冬氨酸磷酸化模拟突变通过增加细胞表面的calnexin信号并减少MAM上的calnexan信号，部分复制了PACS-2敲除。PACS-2敲除不会减少其他ER标记的保留。因此，我们的结果表明，calnexin胞质结构域的磷酸化状态及其与PACS-2的相互作用将这种伴侣分子分类在内质网结构域和质膜结构域之间。

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数字

图1。
图1。
CNX的鉴定，PACS-2的潜在相互作用体。（A） 犬CNX细胞溶质结构域示意图。残基554和564的CK2位点以红色突出显示，而残基583的ERK-1位点以绿色显示。（B） 一部分CNX与PACS-2共定位于线粒体附近。HeLa细胞在盖玻片上生长24小时，并进行免疫荧光显微镜检查。用小鼠单克隆抗体（BD Biosciences）检测CNX，用兔多克隆抗血清（604）检测PACS-2，用预加载的线粒体检测线粒体。底行，放大区域，用覆盖图上的白色边框指示。白色箭头，PACS-2/线粒体重叠；红色箭头，三重重叠。比例尺，25μm。
图2。
图2。
CNX根据其磷酸化状态与PACS-2相互作用。（A） 使用CNX细胞溶质域拉下转染的标记PACS蛋白。在pcDNA3中转染或不转染HA标记的PACS-1或PACS-2 HeLa细胞。GST标记的CNX细胞溶质结构域用于下拉材料。使用抗HA抗体在蛋白质印迹上测定相关蛋白。对两个独立的实验进行了量化。（B） CNX/HA-PACS-2联合免疫沉淀。在pcDNA3中用HA标记的PACS-2转染HeLa细胞或不转染。裂解物与抗HA单克隆抗体孵育，免疫沉淀物通过Western blot分析相关CNX。对三种硅酸盐进行量化。（C） CNX体外结合。左侧，与GST对照组相比，检测PACS-2（furin-binding region，FBR）硫氧还蛋白（TRX）标记的货物结合域与GST标记的CNX细胞溶质尾部的结合。对，TRX-PACS-2FBR与GST或GST标记的CNX尾部一起孵育，之前是否与蛋白激酶CK2孵育。用抗GST抗体通过Western blot检测结合分子。通过Ponceau染色验证了等负荷（数据未显示）。对三个独立实验进行了量化。（D） CNX尾部删除。顶部的图表显示了与野生型CNX（顶部，503-592）相比，缺失及其第一个和最后一个残基。用方框符号表示的还有两个CK2站点。凝胶显示检测到PACS-2（FBR）硫氧还蛋白（TRX）标记的货物结合域与GST标记的CNX细胞溶质尾部缺失的结合。
图3。
图3。
PACS-2基因敲除改变了CNX和线粒体染色模式，但对BAP31的影响不大。用打乱寡核苷酸（a–D）转染细胞和PACS-2 siRNA（E–H）转染的细胞在盖玻片上生长，并在Mitotracker加载（B和F）后用抗CNX（a和E）和抗BAP31抗血清（C和G）进行免疫荧光处理。叠加图片显示所有三个标记（D和H）。插图显示了指定的放大倍数。CNX与线粒体重叠用绿色箭头表示，而CNX与BAP31重叠用红色箭头表示。如Simmen所述，通过特征性线粒体断裂鉴定PACS-2缺失细胞等。(2005). 比例尺，25μm。
图4。
图4。
PACS-2依赖于CNX和BAP31的细胞内贩运。（A） PACS-2敲除后的ER和高尔基体分馏。HeLa细胞被PACS-2耗尽或不被PACS-2耗尽，并且细胞膜在不连续的Optiprep梯度上被分级。标记蛋白表示细胞表面（生物素化蛋白）、高尔基体（β-COP）、ERGIC（ERGIC53）、rER（核黄素I）、MAM（ACAT1）和线粒体（线粒体复合体II）。标记蛋白不受PACS蛋白敲除的影响。通过四个独立实验对CNX分布进行了量化。菱形和虚线，控制数据；正方形和实线，PACS-2击倒。分数5和6中的信号p<0.05。（B） 裂解物分馏。HeLa裂解物被分为重膜、轻膜和胞浆；检测裂解产物中的指示标记。（C） PACS-2敲除后的CNX和BAP31膜分离。将HeLa细胞中的PACS-2耗尽或未耗尽，将细胞膜分为低速和高速颗粒，通过Western blot分析CNX、全长BAP31、PDI、核磷蛋白I和肌动蛋白。我们量化了单个蛋白质相对于总信号的重定位。对三个实验进行了量化。CNX和所有其他标记物之间p<0.05。（D） PACS-1和PACS-2击倒后的CNX表面靶向。HeLa细胞被PACS-1或PACS-2耗尽2天，或被模拟转染。生物素化表面CNX通过Western blots定量（n=3）。CNX的量用总裂解物负荷控制（插图）的10%表示为总裂解物的百分比。siPACS-2和其他两种情况之间的p<0.05。（E） zVAD-fmk孵育抑制PACS-2敲除后BAP31p20的形成。检测全长BAP31和BAP31p20的总裂解物。（F） 在有或无PACS-2的情况下，分析thapsigargin诱导凋亡时BAP31p20的形成。无论PACS-2是否耗尽HeLa细胞，用1μM thapsigargin诱导细胞凋亡16 h。细胞膜被分为低和高速颗粒，通过Western blot分析全长和裂解的BAP31。
图5。
图5。
CNX的PACS-2结合基序突变。（A） PACS-2–结合基序特征。硫氧还蛋白（TRX）标记的PACS-2（FBR）与GST标记的CNX尾部结构体（全长尾部结构体，SSAA=S554564A，SSDD=S55464D）孵育，并使用抗GST抗体通过Western blot检测结合的GST标记分子。通过Ponceau染色验证了等负荷（数据未显示）。TRX-PACS-2信号的强度被量化，并表示为GST信号的倍数（n=3）。SSAA和SSDD之间的p=0.01。（B） CNX+/+和−/−MEF稳定转染剂的膜分数。稳定表达FLAG标记CNX野生型或SSAA/SSDD突变体的CNX−/−MEF被分为重膜和轻膜，并通过Western blot分析FLAG（未显示）或CNX信号。（C） SSAA和SSDD突变体的ER和Golgi分离。用FLAG标记的CNX野生型和SSAA和SSDD突变体瞬时转染HeLa细胞。如图4A所示，在不连续的Optiprep梯度上对细胞裂解产物进行分馏和定量（n=3）。分数6的p<0.01。（D） CNX−/−MEF稳定转染剂中的CNX表面靶向。通过生物素化对稳定表达FLAG标记CNX野生型或SSAA/SSDD突变体的CNX−/−MEF进行分析，通过对FLAG（未显示）或CNX信号的Western blot对表面靶向FLAG标记的CNX构建物进行分析。凝胶中的线条表示为本演示而切割的车道。SSDD与其他结构之间p<0.005。（E） CNX CK2突变体的细胞内定位。用免疫荧光法检测稳定表达FLAG标记的CNX SSAA/SSDD突变体的CNX−/−MEFs，通过将其FLAG信号与内源性PDI和有丝分裂跟踪器共定位来定位转基因。CNX-FLAG SSAA与PDI重叠，线粒体用红色箭头表示。比例尺，25μm。
图6。
图6。
CNX和BAP31的细胞内定位依赖于互变异构体。（A） 纯化COPI、PACS-2和CNX之间形成三元络合物。信号对应于GST-CNX S554564A在存在或不存在TRX标记的PACS-2FBR的情况下固定的β-COP。（B）COPI敲除后的细胞表面CNX和BAP31。检测HeLa对照细胞或β-COP缺失细胞的细胞表面CNX和BAP31。量化细胞表面CNX的相对数量（n=3）。siPACS-2与其他条件之间p<0.05。（C） LDLf细胞中的细胞表面CNX和BAP31（ε-COP对温度敏感）。LDLf细胞在34°C（允许温度）或40°C（导致ε-COP损失）下培养，并分析细胞表面CNX和BAP31。（D） COPI击倒后CNX和BAP31的细胞内定位。β-COP缺失的HeLa细胞用于CNX和BAP31的免疫荧光定位。通过高尔基体扩散和CNX限制鉴定β-COP缺失细胞。比例尺，25μm。
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