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.2008年6月；29(6):1235-43.
doi:10.1093/carcin/bgn095。 Epub 2008年4月15日。

Nrf2增强癌细胞对化疗药物的耐药性，即Nrf2的黑暗面

王晓军 1, 郑孙, 妮可·F·维伦纽夫, 张晓莹, 赵飞, 李彦杰, 陈伟民, 易晓芳, 郑文新, 乔治·温德拉克, 白健旺, 唐娜·D·张
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Nrf2增强癌细胞对化疗药物的耐药性，即Nrf2的黑暗面

王晓军等。 致癌作用. 2008年6月.

摘要

化疗期间的耐药性是许多癌症成功治疗的主要障碍。在这里，我们报道抑制NF-E2-related factor 2（Nrf2）可能是对抗化疗耐药性的一种有希望的策略。Nrf2是一种关键的转录因子，调节细胞保护反应，保护细胞免受多种化学物质的毒性损伤。在正常条件下，Nrf2蛋白的低组成量由Kelch-like ECH-associated protein1（Keap1）介导的泛素化和蛋白酶体降解系统维持。激活后，这种依赖Keap1的Nrf2降解机制迅速失活，导致依赖抗氧化反应元件（ARE）的细胞保护基因的积累和激活。自发现以来，Nrf2被认为是一种“良好”的转录因子，可以保护我们免受多种疾病的侵袭。在这项研究中，我们证明了Nrf2的黑暗面：Nrf2稳定过度表达导致癌细胞对化疗药物（包括顺铂、阿霉素和足叶乙甙）的耐药性增强。相反，通过过度表达Keap1或瞬时转染Nrf2-小干扰RNA（siRNA）下调Nrf2-依赖性反应，使癌细胞更容易受到这些药物的影响。小分子化学物叔丁基对苯二酚（tBHQ）上调Nrf2也增强了癌细胞的耐药性，表明使用Nrf2小分子化学抑制剂作为化疗佐剂以提高化疗药物疗效的可行性。此外，我们提供的证据表明，使用Nrf2抑制剂提高化疗药物疗效的策略不仅限于某些癌症类型或抗癌药物，因此可以在化疗过程中应用于治疗多种癌症类型。

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数字

图1。
图1。
肺癌和癌细胞系中Nrf2依赖性防御反应上调。对来自正常和不同癌症阶段人肺组织的cDNA进行实时逆转录-PCR，以检测NQO1 mRNA的表达。另一个平板中的同一组样品用于检测GAPDH。数据表示NQO1相对mRNA水平归一化为GAPDH。实验进行了三次，并显示了标准偏差。
图2。
图2。
siRNA瞬间击倒Nrf2可使A549肺癌细胞对化疗药物敏感。(A类)从瞬时转染Nrf2–siRNA或对照siRNA的A549细胞中提取mRNA 72小时。将mRNA转化为cDNA后，对等量cDNA进行实时逆转录-PCR分析，以检测Nrf2、NQO1、HO-1和GAPDH的相对mRNA水平。所提供的数据按照GAPDH标准化。(B类)比较转染Nrf2–siRNA或对照siRNA的细胞中的Nrf2蛋白水平(C类)通过DCPIP还原和QuantiChrom谷胱甘肽测定试剂盒分别测定转染细胞的NQO1酶活性和细胞内谷胱甘苷水平。(D类)用Nrf2–siRNA或对照siRNA转染A549细胞72小时，用指定剂量的顺铂、阿霉素和足叶乙甙处理48小时。用MTT法测定细胞活力。数据以平均值±标准偏差表示*P（P）< 0.05.
图3。
图3。
Keap1过表达导致Nrf2的稳定敲除增加A549肺癌细胞对化疗药物的敏感性。(A类)使用基于慢病毒的方法建立了两个稳定表达控制载体或Keap1–CBD的A549衍生细胞系。用抗CBD、Nrf2、NQO1、HO-1和微管蛋白的抗体对这两种细胞系的细胞裂解液进行免疫印迹分析（左面板）。通过减少DCPIP（中间面板）来测量NQO1酶的活性。用QuantiChrom谷胱甘肽测定试剂盒测定两种细胞系的细胞内谷胱甘蛋白水平。(B类)在使用指定剂量的顺铂、阿霉素和足叶乙甙治疗48小时后，通过MTT法评估细胞活力。(C类)用不同剂量的顺铂处理在载玻片上生长的细胞48小时，并使用原位细胞死亡检测试剂盒用荧光素脱氧尿苷三磷酸标记。在荧光显微镜下拍摄照片（左侧面板）。对每张幻灯片的13个字段进行计数，以获得凋亡细胞的总数（表）。(D类)两种细胞系用阿霉素处理48小时；使用细胞死亡检测ELISA测定凋亡细胞死亡加号配套元件。(E类)用顺铂、阿霉素和足叶乙甙处理细胞48小时，并用Annexin V–荧光素异硫氰酸盐和碘化丙啶用Annessin V–荧光素异硫氰盐凋亡检测试剂盒进行染色，然后进行流式细胞术分析。数据以平均值±标准差表示*P（P）< 0.05.
图4。
图4。
Nrf2的稳定过表达增强了MDA-MB-231乳腺癌细胞对化疗药物的耐药性。(A类)使用基于逆转录病毒的方法建立了两个稳定表达控制载体或HA–Nrf2的MDA-MB-231衍生细胞系。比较这两种细胞系中Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA的相对数量。(B类)用抗HA和抗管蛋白抗体进行免疫印迹分析，证实Nrf2过度表达。(C类)治疗48小时后，采用MTT法评估这两种细胞系对顺铂、阿霉素和足叶乙甙的敏感性（55）。数据以平均值±标准偏差表示*P（P）< 0.05.
图5。
图5。
Nrf2的稳定过表达增强了SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞对化疗药物的耐药性。(A类)使用基于慢病毒的方法建立了两个稳定表达控制载体或HA–Nrf2的SH-SY5Y衍生细胞系。测量了Nrf2、NQO1和HO-1的mRNA相对量（第一排顶部三个面板）。免疫印迹分析证实Nrf2和NQO1蛋白水平升高（第二排左侧面板）。测量NQO1酶活性和细胞内谷胱甘肽水平（第二排中间和右侧面板）。(B类)采用MTT法测定这两种细胞系对48小时顺铂治疗的细胞活力。(C类)使用细胞死亡检测ELISA测定顺铂治疗引起的细胞凋亡加号. (D类)顺铂治疗后，使用原位细胞死亡检测试剂盒（左侧面板）用三磷酸荧光素脱氧尿苷标记细胞。在荧光显微镜下计数凋亡细胞的数量，表中列出了每个字段的平均凋亡细胞数量。数据以平均值±标准偏差表示*P（P）< 0.05.
图6。
图6。
用40μM的tBHQ预处理SH-SY5Y细胞24 h。免疫印迹分析检测tBHQ对Nrf2的诱导作用(A类). 然后用规定剂量的(B类)顺铂(C类)阿霉素或(D类)依托泊苷在5μM tBHQ存在下放置48小时，然后进行MTT分析。数据以平均值±标准偏差表示*P（P）< 0.05.
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