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.2008年7月;4(5):621-8.
doi:10.441/auto.5939。 Epub 2008年3月20日。

利用流式细胞术监测哺乳动物细胞的自噬

附属公司

利用流式细胞术监测哺乳动物细胞的自噬

Elena Shvets公司等。 自噬. 2008年7月.

摘要

自噬是一种主要的细胞内分解代谢途径,参与多种生物事件,包括对氨基酸饥饿、蛋白质和细胞器更新、发育、衰老、病原体感染和细胞死亡的反应。然而,由于缺乏自噬标记物,在哺乳动物细胞中监测这一过程的实验方法受到限制。最近,泛素样蛋白(UBL)Atg8的哺乳动物同源物MAP1-LC3(LC3)被证明选择性地结合到自噬体中,从而成为哺乳动物自噬体内唯一的真实标记。然而,目前使用LC3量化自噬活性的方法费时、费力,并且需要大量经验才能准确解释。在这里,我们利用荧光激活细胞分选器(FACS)量化GFP-LC3的周转,作为测量活哺乳动物细胞自噬活性的一种方法。我们发现,在雷帕霉素、膜霉素或饥饿至氨基酸的自噬诱导过程中,GFP-LC3的荧光强度以时间依赖的方式降低。这种减少专门发生在野生型LC3中,但在突变型LC3(G120A)中没有发生,并且被自噬或溶酶体抑制剂抑制,表明该信号对LC3选择性自噬介导传递到溶酶体中是特异的。通过使用该试验,我们测试了自噬过程的最低营养需求,并通过剥夺特定的单一氨基酸来确定其诱导作用。我们的结论是,这种方法可以成功地应用于不同的细胞系,作为一种可靠且简单的方法来量化活哺乳动物细胞中的自噬活性。

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