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.2008年4月1日；105(13):5117-22.
doi:10.1073/pnas.0706700105。 Epub 2008年3月24日。

Ku70依赖性氘化对促凋亡因子Bax的调节

Avigail D Amsel公司 1, 莫兰·拉特豪斯, 诺姆·克伦曼, 哈伊姆·科恩
附属公司

Ku70依赖性去泛素化对促凋亡因子Bax的调节

Avigail D Amsel公司等。 美国国家科学院程序. .

摘要

DNA末端连接蛋白Ku70是通过从线粒体分离促凋亡因子Bax来抑制凋亡的几种蛋白质之一。然而，Ku70依赖性抑制Bax的分子机制尚不完全清楚。在这里，我们表明Ku70的缺失导致泛素化Bax的积累。在正常生长条件下，Bax泛素化促进其降解。在诱导野生型细胞凋亡后，观察到泛素化Bax水平显著降低，而在Ku70（-/-）细胞中，泛素化的Bax大量积累。将重组Ku70添加到Ku70（-/-）细胞的蛋白提取物中，导致泛素化Bax水平降低，即使存在蛋白酶体抑制剂。此外，体外氘化试验表明，重组Ku70将多泛素链水解为单泛素单元。因此，Ku70通过从线粒体隔离Bax并介导Bax氘化来调节细胞凋亡。这些结果揭示了蛋白酶体抑制剂作为肿瘤抑制剂的作用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
Ku70负调控Bax介导的细胞凋亡。Ku70与促凋亡蛋白Bax之间的结合将Bax从线粒体中隔离。在正常生长条件下，NAD将Ku70维持在非乙酰化状态+-依赖性SIRT1脱乙酰酶和迄今尚未鉴定的组蛋白脱乙酰酶（HDAC），使其能够与Bax结合。凋亡刺激后，CBP和PCAF乙酰转移酶乙酰化Ku70上的特异性赖氨酸，导致Ku70构象改变和Bax释放；然后释放的Bax作用于启动细胞凋亡。
图2。
图2。
Ku70水平的降低促进Bax泛素化。(一个)通过在U2OS细胞中过表达针对Ku70的反义或siRNA序列（As-Ku70；siRNA Ku70）来降低Ku70的水平，导致高分子量修饰形式的Bax的积累。(B类)在Ku70中，Bax的高分子量修饰形式明显更丰富−/−MEF与野生型MEF的比较。(C类)将HEK293T细胞与HA标记的泛素表达载体以及对照siRNA（中心泳道）或针对Ku70的siRNA（右泳道）质粒共转染。用抗HA抗体沉淀免疫复合物，用SDS/PAGE分离，并用HRP偶联抗Bax抗体进行免疫印迹。免疫印迹上泛素化Bax的不同大小由小箭头标记。此外，还单独装载了IgG的额外对照物（左车道），以区分来自免疫复合物和泛素化Bax的抗体。(D类)用来自HEK293T的抗Bax抗体沉淀免疫复合物，该抗体过度表达对照siRNA（中间通道）或抗Ku70的siRNA（右通道），并用抗泛素抗体进行免疫印迹。仅IgG也被加载（左车道）。在所有实验中，β-肌动蛋白起到了负荷控制的作用。U、 未改性Bax；M改性Bax。
图3。
图3。
Bax泛素化促进其降解，并在凋亡刺激下降低。(一个)Ku70的治疗−/−含有蛋白酶体抑制剂MG-132的细胞增加了泛素化Bax的水平。(B类)用蛋白酶体抑制剂Bertozomib（Velcade或PS-341）处理过表达抗Ku70 siRNA的HEK293细胞，可增加泛素化Bax的水平。针对过度表达对照siRNA的HEK293细胞验证了Ku70水平的降低（数据未显示）(C类)在staurosporine-STS诱导Bax介导的野生型细胞凋亡之前（0）或之后的不同时间，使用Bax多克隆抗体通过Western blot对泛素化Bax水平进行时间-过程分析。在所有实验中，β-肌动蛋白水平作为负荷控制。U、 未改性Bax；M、 改良Bax。
图4。
图4。
Ku70介导Bax氘化。(一个)staurosporine-STS诱导Bax介导的Ku70细胞凋亡前（0）或诱导后不同时间用Bax多克隆抗体Western blot分析泛素化Bax水平−/−细胞。(B类)体外Ku70中Bax的氘化反应−/−补充PBS或重组Ku70-rKU70的细胞提取物。(C类)体外Ku70中Bax的氘化反应−/−在蛋白酶体抑制剂MG-132存在下生长的细胞。用PBS或rKu70补充提取物。(D类)在添加DMSO或蛋白酶体抑制剂MG-132的培养基中生长的野生型细胞中泛素化Bax的水平。(E类)体外对添加BSA和rKu70的均质四泛素链进行不同时间段的氘化分析，证明Ku70具有固有的DUB酶活性。仅将四泛素或四泛素与BSA共同孵育，并没有诱导四泛素链水解为单泛素单元。在A–D，β-肌动蛋白水平作为负载对照。U、 未改性Bax；M、 改良Bax。
图5。
图5。
提出了Ku70调控Bax介导的细胞凋亡的模型。新合成的Bax经历泛素化，通过标记其蛋白酶体降解来负向调节其促凋亡功能。Bax泛素化后与Ku70结合，Ku70介导Bax氘化，同时产生Bax活性形式并将其从线粒体中隔离。在凋亡刺激后，Ku70被CBP或PCAF乙酰化并释放Bax。然后，游离的细胞溶质中未泛素化的Bax可以定位于线粒体，在线粒体中执行程序性细胞死亡。
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