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.2008年4月1日；180(7):4586-95.
doi:10.4049/jimmunol.180.7.4586。

肥大细胞中mTORC1通路的激活和功能

金美善 1, 惠孙奎, 院长D Metcalfe, 阿拉斯代尔·吉尔费兰
附属公司

肥大细胞中mTORC1通路的激活和功能

Mi-Sun Kim先生等。 免疫学杂志. .

摘要

在FcepsilonRI聚集和Kit结扎后，调节肥大细胞内环境稳定和功能的PI3K下游信号知之甚少。在本研究中，我们研究了雷帕霉素复合物1（mTORC1）通路的哺乳动物靶点在这些反应中的作用。在人类和小鼠肥大细胞中，通过FcepsilonRI或Kit的刺激导致mTORC1途径显著的PI3K依赖性激活，如块茎蛋白、mTOR、p70S6激酶（p70S6K）和4E-BP1的沃特曼敏感性顺序磷酸化所示。相反，在人类肿瘤肥大细胞中，mTORC1通路被组成性激活，这与mTORC2通路成分水平显著升高有关。雷帕霉素是mTORC1的特异性抑制剂，选择性地完全阻断FcepsilonRI和Kit诱导的mTORC1-依赖性p70S6K磷酸化，并部分阻断4E-BP1磷酸化。同时，尽管雷帕霉素对FcepsilonRI介导的脱颗粒或Kit介导的细胞粘附没有影响，但它抑制了细胞因子的产生、Kit介介导的趋化性和细胞存活。此外，雷帕霉素还阻断了mTORC1通路的组成性激活，并抑制肿瘤肥大细胞的细胞存活。这些数据证明，mTORC1是FcepsilonRI和Kit的PI3K调节下游事件的一个分歧点，用于选择性调节肥大细胞功能。具体而言，mTORC1通路可能在肥大细胞稳态的正常和失调控制中发挥关键作用。

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数字

图1
图1
HuMC中FcεRI聚集或Kit活化后PI3K和mTORC1途径活化的动力学。HuMC用生物素化的人IgE致敏，并用（A）链霉亲和素（SA，100 ng/ml）或（B）人SCF（30 ng/ml）触发。在刺激后的指定时间检查LAT/NTAL、Akt、tubin、mTOR、p70S6K和4E-BP1的磷酸化。从三个独立的实验中显示了具有代表性的印迹。对印迹进行扫描，并将数据计算为最大响应百分比，如底部面板所示。密度测定数据表示为三个独立实验的方法。为了清晰起见，已移除SEM条。
图2
图2
人类肥大细胞系中mTORC1通路的表达和磷酸化的比较。CD34型+-将衍生培养的HuMC、LAD 2、HMC-1.1和HMC-1.2细胞去除细胞因子4 h，并分析磷酸-mTOR、mTOR、磷酸-p70S6K、p70S6K，磷酸-4E-BP1和4E-BP1的水平。总Syk和Actin的水平显示了等效的蛋白质负荷。
图3
图3
BMMC中PI3K和mTORC1通路对Ag或SCF的反应动力学。用抗鼠DNP-IgE致敏小鼠BMMC，并用（A）DNP-HSA（Ag，100 ng/ml）或（B）小鼠SCF（30 ng/ml）触发。在刺激后的指定时间检查LAT/NTAL、Akt、tubin、mTOR、p70S6K和4E-BP1的磷酸化。三个独立实验显示了一个具有代表性的印迹。扫描所有印迹，并计算数据作为最大响应的百分比，如底部面板所示。密度测量数据表示为三个独立实验的结果。为了清晰起见，已移除SEM条。
图4
图4
PI3K抑制和p110δ失活对Akt磷酸化和mTORC1途径成分的影响。（A） BMMC用或不用wortmannin（Wort，100nM）处理20分钟，然后用DNP-HSA（Ag，100ng/ml）或SCF（30ng/ml）刺激10分钟，然后评估Akt、块茎蛋白、mTOR、p70S6K和4E-BP1的磷酸化。（B） 来源于野生型（WT）和p110δ的BMMCD910A/D910A用Ag（100 ng/ml）或SCF（30 ng/ml）刺激小鼠10分钟。制备总细胞裂解物，并分析Akt、块茎蛋白、mTOR、p70S6K和4E-BP1的磷酸化。（C） 用或不用p110δ（10µM）的特异性抑制剂IC87114处理BMMC 20分钟，然后用DNP-HSA（Ag，100 ng/ml）或SCF（30 ng/ml）刺激10分钟。Akt、tuberin、mTOR、p70S6K和4E-BP1的磷酸化分析如上。从两个独立的实验中获得了类似的结果。
图5
图5
雷帕霉素对mTOR、p70S6K和4E-BP1磷酸化以及mTORC1组装的影响。将BMMC在有或无雷帕霉素（Rapa，100 nM）的条件下培养20分钟，然后用DNP-HSA（Ag，100 ng/ml）或SCF（30 ng/ml）刺激10分钟。（A）分析mTOR、p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平和总表达。从三个独立的实验中获得了类似的结果。（B，C）BMMC用1–100 nM雷帕霉素处理20分钟，用Ag（B，100 ng/ml）或SCF（C，30 ng/ml，10分钟）刺激，然后分析磷酸化水平和p70S6K和4E-BP1的总表达。密度测定数据表示为五个独立实验的平均值±SEM。（D） 用雷帕霉素处理或不处理细胞裂解液制备猛禽免疫沉淀物。通过mTOR和猛禽的免疫印迹分析免疫沉淀物和总细胞裂解物。这些斑点代表了三个类似的结果。
图6
图6
雷帕霉素对Ag诱导的肥大细胞反应的影响。（A） Ag（DNP-HSA，100 ng/ml）诱导脱颗粒动力学（左图）。用雷帕霉素（Rapa）或沃特曼宁（Wort）处理致敏的BMMC，然后用Ag激发30分钟（右图）。按照“材料和方法”中的描述，通过监测上清液和全细胞裂解液中的β-己糖胺酶（β-hex）活性来评估脱颗粒。（B） Ag（100 ng/ml）诱导肥大细胞释放IL-6的动力学（左面板）。用抑制剂处理致敏的BMMC，然后在无银或有银的情况下孵育6小时。通过ELISA分析无细胞上清液中的IL-6水平（右侧面板）。（C） 在没有或存在雷帕霉素（Rapa，100 nM）的HuMC中检测FcεRI介导的脱颗粒和（D）IL-8释放。所示的所有数据均为重复进行的四个独立实验的平均值±SEM。*与载体预处理的Ag或SA刺激细胞相比，p<0.05。
图7
图7
雷帕霉素对SCF诱导的肥大细胞反应的影响。对于Kit介导的肥大细胞反应，在指定的时间点（每个左面板）检查SCF（30 ng/ml）诱导的细胞功能动力学。数据表示为两次或三次独立实验的平均值±SEM，一式两份。用雷帕霉素（Rapa）或沃特曼（Wort）对BMMC进行预处理，然后在没有或存在SCF（30 ng/ml）的情况下培养。（A） 在37°C下培养1小时后，按照“材料和方法”中的描述测量细胞对纤维连接蛋白的粘附。（B） 培养4小时后，使用“材料和方法”中描述的跨阱分析测定对SCF的趋化性。（C） 培养6 h后，用ELISA法分析无细胞上清液中的IL-6水平。（D） 培养48小时后，通过MTT比色法评估肥大细胞的存活率。以SCF反应的百分比计算抑制剂处理细胞的存活率。（E） 在没有或存在雷帕霉素（Rapa，100 nM）的HuMC中，分析SCF诱导的趋化性和（F）SCF诱导细胞存活。所有数据均以重复进行的四个独立实验的平均值±SEM表示。*与载体预处理的SCF刺激细胞相比，p<0.05。
图8
图8
雷帕霉素对人肥大细胞系的影响。（A） 所有细胞系在没有或存在雷帕霉素（Rapa，100 nM）的情况下培养24小时，然后通过Western blotting分析mTORC1通路成分的磷酸化和表达水平。（B） 在加入或不加入雷帕霉素（Rapa，100 nM）培养48小时后，评估细胞存活和/或增殖。所有数据均以一式三份的两个独立实验的平均值±SEM表示。*与溶媒预处理的对照细胞相比，p<0.05。
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