Mammalian target of rapamycin repression by 3,3'-diindolylmethane inhibits invasion and angiogenesis in platelet-derived growth factor-D-overexpressing PC3 cells

doi:10.1158/0008-5472.CAN-07-3241

.2008年3月15日；68(6):1927-34.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-07-3241。

雷帕霉素被3,3'-二内酰甲烷阻遏的哺乳动物靶点抑制血小板衍生生长因子-D过度表达PC3细胞的侵袭和血管生成

德胡安·孔¹, 桑吉夫·巴纳吉, 黄伟, 李一伟, 王志伟, Hyeong-Rhe Choi Kim先生, 法兹鲁·萨卡尔

附属公司

PMID： 18339874
预防性维修识别码：项目经理3757473
DOI（操作界面）： 10.1158/0008-5472.CAN-07-3241

雷帕霉素被3,3'-二内酰甲烷阻遏的哺乳动物靶点抑制血小板衍生生长因子-D过度表达PC3细胞的侵袭和血管生成

德胡安·孔等。癌症研究. 2008.

.2008年3月15日；68(6):1927-34.

doi:10.1158/0008-5472.CAN-07-3241。

作者

德胡安·孔¹, 桑吉夫·巴纳吉, 黄伟, 李一伟, 王志伟, Hyeong-Rhe Choi Kim先生, 法兹鲁·萨卡尔

附属

¹美国密歇根州底特律市韦恩州立大学医学院卡马诺斯癌症研究所病理学系，邮编：48201。

PMID： 18339874
预防性维修识别码：项目经理3757473
DOI（操作界面）： 10.1158/0008-5472.CAN-07-3241

摘要

血小板衍生生长因子D（PDGF-D）是一种新发现的生长因子，已知其可调节多种细胞过程，包括细胞增殖、转化、侵袭和血管生成。最近的研究表明，PDGF-D及其同源受体PDGFR-β在前列腺癌组织中表达，提示PDGF-D可能在前列腺癌的发生发展中起重要作用。然而，PDGF-D在肿瘤发生中的生物学作用仍然难以捉摸。在本研究中，我们发现PDGF-D过表达PC3细胞（稳定转染PDGF-DcDNA的PC3细胞，简称为PC3 PDGF-D）表现出快速的生长速度和增强的细胞侵袭性，这与雷帕霉素哺乳动物靶点（mTOR）的激活和Akt活性的降低有关。雷帕霉素抑制mTOR活性，同时导致Akt活化，这可能减弱mTOR抑制剂的治疗效果。相反，B-DIM（来自Biorense，Inc.的BR-DIM；一种化学预防剂）显著抑制PC3 PDGF-D细胞中的mTOR和Akt，这与细胞增殖和侵袭降低有关。此外，来自PC3 PDGF-D细胞的条件培养液显著增加了人脐静脉内皮细胞的管形成，而B-DIM治疗可抑制其管形成，同时PDGF-D-全长和活性形式减少。我们的研究结果表明，B-DIM可以通过失活PDGF-D过表达前列腺癌中的mTOR和Akt活性，作为一种新的有效的化学预防和/或治疗剂。

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图1
PDGF-D促进PC3细胞增殖。A类将PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞接种在5%FBS中的96个平板中，并培养24、48和72小时。细胞在37°C和5%CO的培养基中与细胞增殖试剂WST-1培养4小时₂使用超多功能微孔板阅读器在450/595 nm处测定分光光度吸光度。点数，平均值(n个= 6);钢筋，SE。**，*P（P）*与对照组相比<0.01。B类PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞在含有5%FBS的培养基中孵育48小时，培养基中PDGF-D的全长和活性形式。

图2
PDGF-D诱导mTOR通路激活和生存因子Bcl-2表达，同时Akt失活。A类将PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞接种在5%FBS中的100-mm板中。48h后，制备细胞裂解物，并对等量的蛋白质进行凝胶电泳。使用抗磷酸化-mTOR（Ser²⁴⁴⁸)，mTOR，磷-p70S6K（Thr³⁸⁹)、S6K、磷酸-4E-BP1（Thr³⁷/瑟⁴⁶)，4E-BP1，磷酸化-Akt（Ser⁴⁷³)、Akt和Bcl-2。β-肌动蛋白作为负荷控制。B类对PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞中磷酸化-mTOR、磷酸化-p70S6K、磷酸化-4E-BP1、磷酸化-Akt和Bcl-2的表达进行定量分析，并将条带的相对密度归一化为β-actin（PC3-Neo，赋值为100%）。柱，平均值(n个= 4);钢筋，东南部**，*P（P）*与PC3 Neo相比<0.01。C类将PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞接种并培养24 h。细胞用10 nmol/L雷帕霉素处理(*R（右）*)，10μmol/L LY294002(*L（左）*)，10 nmol/L雷帕霉素与10μmol/L LY294002联用(*右+左*)，或DMSO控制(C类)孵育8小时后，制备细胞裂解物，并对等量的蛋白质进行凝胶电泳。使用抗磷酸化Akt、Akt和磷酸化p70S6K（Thr³⁸⁹)和p70S6K。β-肌动蛋白作为负荷控制。

图3
B-DIM和雷帕霉素抑制mTOR通路，雷帕霉素而非B-DIM导致PC3 PDGF-D细胞中Akt的激活。将PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞接种在5%FBS中的100-mm板中。24小时后，用10nmol/L雷帕霉素处理细胞0.5至48小时(A类)或用0、10和100 nmol/L雷帕霉素处理8小时(B类). 如上所述接种细胞，并用10μmol/L B-DIM处理0.5至48 h(C类)或用0、10和25μmol/L B-DIM处理16小时(D类). 制备细胞裂解物，并对等量的蛋白质进行凝胶电泳。使用抗mTOR、phospho-mTOR（Ser²⁴⁴⁸)，p70S6K，磷酸化-p70S6K（Thr³⁸⁹)，4E-BP1，磷酸化-4E-BP1（Thr³⁷/瑟⁴⁶)、Akt和磷酸化Akt（Ser⁴⁷³). β-肌动蛋白作为负荷控制。

图4
B-DIM比雷帕霉素更有效地抑制细胞增殖，B-DIM减少PDGF-D的全长和活性形式。PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞接种在96周板中。24小时后，用0、1、10和100 nmol/L雷帕霉素处理细胞(A类)或用0、10和25μmol/L B-DIM处理(B类)处理后，将细胞与细胞增殖试剂WST-1在37°C和5%CO的培养基中孵育4 h₂使用超多功能微孔板阅读器在450/595 nm处测定分光光度吸光度。相对于PC3 Neo对照组计算活细胞，赋值为100%(n个= 6; #,*P（P）*<0.05和*，*P（P）*与PC3 Neo或PC3 PDGF-D对照组相比<0.01）。C类和D类将PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞接种在5%FBS中的100-mm板中。24 h后，用0、10和25μmol/L B-DIM在0.5%FBS中处理细胞48 h。收集CM并制备细胞裂解液。CM和等量的蛋白质进行凝胶电泳，并使用PDGF-D抗体进行Western blot分析。

图5
B-DIM抑制PC3 PDGF-D细胞的侵袭，而经B-DIM处理的PC3 PDGF-D细胞中的CM可减少HUVEC的管形成。A类使用BD BioCoat肿瘤侵袭检测系统测定B-DIM治疗对细胞侵袭的影响。侵袭性细胞用4μg/mL钙化蛋白AM染色。B-DIM（10和25μmol/L）显著降低PC3 PDGF-D细胞的侵袭性。B类在含有0.5%FBS的培养基中培养的PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞用B-DIM或DMSO处理48 h。收集CM进行血管生成分析（由HUVEC形成管）。将HUVEC接种在涂有生长因子-降低基质的八周培养箱的每个孔中。将该室孵育8或24小时。使用带数码相机的倒置显微镜对每个孔进行拍照。使用从NIH网站下载的软件图像分析程序Scion Image对小管/毛细管长度进行图像分析。C类，入侵细胞的相对荧光值。该值表示侵入细胞的相对数量。D类，使用软件图像分析程序Scion image对小管/毛细血管长度进行图像分析。孵育8小时的内皮细胞的累积管长度的定量(左边)和24小时(*正确的*).柱，平均值；钢筋、SE；n个= 4. #,*P（P）*与CMN.*相比<0.01，*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*与CMD相比<0.01(*CMN公司*，来自PC3 Neo细胞的CM；*CMD公司*、来自PC3 PDGF-D细胞的CM；*命令10*10μmol/L B-DIM处理PC3 PDGF-D细胞的CM；*CMDB25号机组*25μmol/L B-DIM处理的PC3 PDGF-D细胞CM）。

图6
mTOR和raptor的敲除减少了PC3 PDGF-D细胞的侵袭，而来自PC3 PDGF-D的CM通过mTOR或raptor的击倒减少了HUVEC的管形成。A类，PC3 PDGF-D细胞转染mTOR、raptor或对照(*反对的论点*)siRNA。转染48小时后，收集细胞进行侵袭试验。B类，细胞按上述方法处理。收集CM用于试管形成分析。C类，入侵细胞的相对荧光值代表入侵细胞的比较数量(左边). 内皮细胞孵育8h后累积管长的量化(*正确的*).柱，平均值(n个= 4);钢筋，东南*，*P（P）*< 0.05, **,*P（P）*与对照组相比<0.01。D类Western blot分析显示转染mTOR、raptor或对照siRNA的PDGF-D细胞中mTOR，raptor，p-S6K和p-4E-BP1的表达水平。以β-肌动蛋白作为负荷对照。

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