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.2008年5月；28(10):3457-64.
doi:10.1128/MCB.02019-07。 Epub 2008年3月10日。

SWI/SNF介导INK4b-ARF-INK4a位点的多梳驱逐和表观遗传重编程

西玛·赫拉德曼德·起亚 1, 马金·高斯基（Marcin M Gorski）, 斯塔夫罗斯·吉安娜科普洛斯, C Peter Verrijzer先生
附属公司

SWI/SNF介导INK4b-ARF-INK4a位点的多梳驱逐和表观遗传重编程

Sima Kheradmand起亚等。 分子细胞生物学. 2008年5月.

摘要

INK4b-ARF-INK4a抑癌基因座的稳定沉默发生在多种人类癌症中，包括恶性横纹肌样肿瘤（MRT）。MRT是由SWI/SNF染色质重塑复合物hSNF5亚单位缺失引起的极度侵袭性癌症。我们之前发现，在MRT细胞中，hSNF5是p16（INK4a）诱导、有丝分裂检查点激活和细胞衰老所必需的。在这里，我们研究了Polycomb群（PcG）沉默和SWI/SNF激活之间的平衡如何影响MRT细胞中INK4b-ARF-INK4a位点的表观遗传控制。MRT细胞中hSNF5的再表达导致SWI/SNF的募集和p15（INK4b）和p16（INK4 a）的激活，但不引起p14（ARF）的激活。hSNF5的基因激活严格依赖于SWI/SNF运动亚基BRG1。SWI/SNF介导PRC1和PRC2 PcG沉默子的驱逐和广泛的染色质重编程。在去除PcG复合物的同时，混合系白血病1（MLL1）蛋白被招募，活性组蛋白标记为替代抑制性组蛋白。引人注目的是，PcG复合物的丢失伴随着DNA甲基转移酶DNMT3B的离解和DNA甲基化的降低。因此，SWI/SNF作用可以调节各种染色质状态。总之，这些发现强调了癌症和基因控制中不同染色质修饰的紧密联系和动态。

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数字

图1。
图1。
hSNF5在MRT细胞中的再表达诱导p15墨水4b和第16页墨水4a但不是p14农业研究基金（A）人类INK4b-ARF-INK4a基因座的组织（未按比例绘制）。基因组位点跨越人类9号染色体约40 kbp，编码三种不同的蛋白质：p15墨水4b，第14页农业研究基金和第16页墨水4a.5′和3′非翻译区域（黄色框）第15页墨水4b（绿色），第14页农业研究基金（蓝色），和第16页墨水4a（红色）。（B） 用表达GFP（lane1）或hSNF5（lane2。用SDS-PAGE解析细胞裂解产物，并用hSNF5抗体进行免疫印迹分析。组蛋白H3用作负荷控制。（C） RT-qPCR分析MRT细胞基因表达揭示hSNF5依赖性诱导第15页墨水4b和第16页墨水4a，而第14页应收账F类转录不受影响。用表达GFP（黄色条）或hSNF5（蓝色条）的慢病毒转导48小时后收集细胞。采用RT-qPCR分析分离的mRNA，以确定第15页墨水4b,第16页墨水4a,第14页农业研究基金、和美国药典14（独立于hSNF5的控制基因）。mRNA水平绘制为美国药典14mRNA×0.006。条形图表示三个独立的生物复制品的平均值，每个复制品通过三个单独的qPCR反应进行分析。显示了标准偏差。（D） 用ChIP-qPCR分析RNA Pol II启动子结合。交叉连接染色质是由缺乏hSNF5但表达GFP（浅绿色条）的MRT细胞或表达hSNF4（深绿色条）细胞制备的。这里提供的所有ChIP数据都是至少三个独立实验的结果。通过qPCR测定免疫沉淀物中特定DNA序列的丰度，并针对每个引物集独立测定的扩增曲线进行校正。背景水平由ChIP使用针对无关蛋白（GST）的物种和同种匹配免疫球蛋白确定。使用对应于RNA Pol II的引物集，通过qPCR分析带有抗体的ChIP第15页墨水4b,第14页农业研究基金、和第16页墨水4a发起人。每个区域的ChIP信号水平以输入染色质的百分比表示。
图2。
图2。
hSNF5调节BRG1的招募第15页墨水4b和第16页墨水4a发起人。（A） 对hSNF5与INK4b-ARF-INK4a位点结合的ChIP-qPCR分析表明，hSNF4直接与第15页墨水4b和第16页印度航空公司发起人，但不是第14页农业研究基金从缺乏（浅绿色条）或表达（深绿色条）hSNF5的MRT细胞中分离出交叉连接染色质。qPCR引物组对应于第15页墨水4b发起人（A）第14页农业研究基金启动子（B）、基因间控制区（C）和第16页墨水4a轨迹（将D设置为I）。底漆组E和F覆盖第16页墨水4a发起人。放大区域在INK4b-ARF-INK4a轨迹显示在底部。（B） BRG-1绑定到第15页墨水4b和第16页墨水4aChIP-qPCR显示，启动子依赖于hSNF5，具有针对BRG-1的抗体。程序如图1图例所示。
图3。
图3。
BRG1是hSNF5介导的第15页墨水4b和第16页墨水4a（A）使用慢病毒转导和表达shRNA靶向病毒，对BRG1敲除4天后制备的MON细胞提取物中BRG1蛋白水平进行Western blot分析BRG1公司mRNA（克隆15549；Open Biosystems；顶部面板，第3和第4道）。作为对照，用表达GFP的慢病毒转导细胞。在用表达GFP-或shRNA-的慢病毒转导后的一天，细胞再次被表达GFP（中间面板，第1和第3道）或hSNF5（第2和第3道道）的病毒转导。在hSNF5表达72小时后制备细胞提取物。组蛋白H3用作负荷控制。（B） BRG1的缺失会取消第15页墨水4b和第16页墨水4a通过hSNF5。的相对表达水平第15页墨水4b,第14页农业研究基金、和第16页墨水4a在hSNF5表达72小时后，通过RT-qPCR检测这些细胞中分离的mRNA。条形图表示三个独立实验的平均值，每个实验用RT-qPCR分析三次。
图4。
图4。
SWI/SNF的恢复会导致PcG沉默子的清除和H3-K27甲基化的丧失。使用针对BMI1（A）、EZH2（B）、SUZ12（C）和H3-K27me3（D）的抗体进行ChIP。从缺乏（黄色条）或表达（深绿色条）hSNF5的MRT细胞中分离出交叉连接染色质。ChIP通过qPCR进行分析，使用对沿INK4b-ARF-INK4a轨迹，显示PcG消音器的结合峰值在第16页墨水4a发起人。hSNF5诱导后，PRC1（BMI1）和PRC2（EZH2和SUZ12）均被去除，H3-K27me3显著降低。H3-K27me3 ChIP归一化为H3 ChIP。程序如图1图例所示。（E） hSNF5表达不影响BMI1、SUZ12和EZH2水平。表达GFP或SNF5的慢病毒转导的MON细胞中BMI1、SUZ12和EZH2表达的Western免疫印迹分析。用SDS-PAGE解析细胞裂解产物，并分别用BMI1、SUZ12和EZH2抗体进行免疫印迹分析。组蛋白H3用作负荷控制。
图5：。
图5。
hSNF5诱导H3-K4甲基化酶MLL1的募集。具有针对H3-K4me3（A）和MLL1（B）抗体的ChIP显示H3-K4me3和MLL1-结合增加第15页墨水4b和第16页墨水4ahSNF5表达后。从缺乏（黄色条）或表达（深绿色条）hSNF5的MRT细胞中分离出交叉连接染色质。使用A至I所示区域的特异引物集，通过qPCR对ChIP进行分析INK4b-ARF-INK4a轨迹。组蛋白H3-K4me3 ChIP被归一化为组蛋白H3 ChIP。程序如图1图例所示。
图6。
图6。
DNA甲基化缺失第16页墨水4aSWI/SNF恢复后的启动子。（A） CpG DNA甲基化变化的MeDIP分析第16页墨水4a发起人，窝藏一个CpG岛。该区域内的许多其他地区（没有CpG岛屿）INK4b-ARF-INK4a扩增基因座作为对照。印迹和高甲基化H19型基因被用作参考。从缺乏（黄色条）或表达（深绿色条）hSNF5的MRT细胞中分离出基因组DNA。在MboI消化和变性后，使用针对5-甲基胞嘧啶的抗体进行MeDIP，并使用qPCR进行定量。结合以输入DNA的百分比表示。条形图表示三个独立的MeDIP实验的平均值，每个实验通过qPCR进行三次分析。（B） SWI/SNF的重新激活导致DNA甲基转移酶DNMT3B的丢失，正如从MRT细胞分离的染色质上的ChIP所揭示的那样，这些染色质要么缺乏（黄色条），要么表达（深绿色条）hSNF5。使用A-I所示区域的特异引物集，通过qPCR对ChIP进行分析INK4b-ARF-INK4a轨迹。程序如图1图例所示。（C） hSNF5表达不影响DNMT3B表达水平。表达GFP或SNF5的慢病毒转导的MON细胞中DNMT3B的免疫印迹分析。组蛋白H3用作负荷控制。（D） DNA甲基化抑制剂治疗和hSNF5表达对第15页墨水4b和第16页墨水4a归纳。MON细胞经模拟处理或与50μmol 5-azadC/升孵育。大约48小时后，用表达GFP或hSNF5的慢病毒转导细胞。的相对表达水平第15页墨水4b,第14页农业研究基金、和第16页墨水4a通过RT-qPCR对分离的mRNA进行测定。条形图表示三个独立实验的平均值，每个实验用RT-qCR分析三次。
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