HIV-1 Nef binds PACS-2 to assemble a multikinase cascade that triggers major histocompatibility complex class I (MHC-I) down-regulation: analysis using short interfering RNA and knock-out mice

doi:10.1074/jbc.M707572200

。2008年4月25日；283(17):11772-84.

doi:10.1074/jbc。M707572200。 Epub 2008年2月22日。

HIV-1 Nef结合PACS-2组装多激酶级联反应，触发主要组织相容性复合体I类（MHC-I）下调：使用短干扰RNA和敲除小鼠进行分析

凯特琳·M·阿特金斯¹, 劳雷尔·托马斯, 罗伯特·T·尤克, 梅兰妮·哈里夫, 弗朗科·皮萨尼, 惠鸿游, 加里·托马斯

附属公司

PMID： 18296443
预防性维修识别码：项目经理2431057
内政部： 10.1074/jbc。M707572200型

HIV-1 Nef结合PACS-2组装多激酶级联反应，触发主要组织相容性复合体I类（MHC-I）下调：使用短干扰RNA和敲除小鼠进行分析

凯特琳·M·阿特金斯等。生物化学杂志。 2008。

。2008年4月25日；283(17):11772-84.

doi:10.1074/jbc。M707572200。 Epub 2008年2月22日。

作者

凯特琳·M·阿特金斯¹, 劳蕾尔·托马斯, 罗伯特·T·尤克, 梅兰妮·哈里夫, 弗朗科·皮萨尼, 惠鸿游, 加里·托马斯

附属

¹美国俄勒冈州波特兰Vollum研究所，邮编：97239。

PMID： 18296443
预防性维修识别码：项目经理2431057
内政部： 10.1074/jbc。M707572200型

摘要

人类免疫缺陷病毒1型阴性因子（Nef）通过组装Src家族激酶（SFK）-ZAP70/Syk-磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）级联，通过Nef EEEE（65）和PXXP（75）两个位点的顺序作用，启动细胞表面主要组织相容性复合体I（MHC-I）的下调。然后，内化的MHC-I分子通过一个需要Nef-Met的过程被隔离在内胚体室中（20）。Nef如何组装多激酶级联来触发MHC-I下调途径尚不清楚。在这里，我们报告了EEEE（65）依赖性结合分选蛋白PACS-2靶向核旁区域的Nef，使PXXP（75）结合并激活反高尔基网络（TGN）定位的SFK。然后，该SFK磷酸化ZAP-70，通过与p85 C末端Src同源2结构域的相互作用招募I类PI3K。利用PACS-2（-/-）小鼠的脾细胞和胚胎成纤维细胞，我们从遗传学上证实Nef需要PACS-2定位于核旁区域并组装多激酶级联。此外，PACS-2的基因丢失或I类PI3K的抑制阻止了Nef介导的MHC-I下调，表明PACS-2短干扰RNA敲除现象复制了基因敲除。PACS-2依赖性靶向途径并不局限于Nef，因为PACS-2也是从早期内体向TGN转运内吞阳离子非依赖性甘露糖6-磷酸受体报告子所必需的。总之，这些结果表明，在TGN/内体系统中，PACS-2是Nef作用和流动膜货物分类所必需的。

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数字

**图1。**
**Nef EEEE公司⁶⁵-与PACS-1和PACS-2的依赖性结合。** *A、，*净化他的₆PACS-1号机组_快堆（残留物117-294）或他的₆PACS-2系列_快堆（残基38-217）与GST孵育，GST-Nef或GST-NefE4A与谷胱甘肽-脑葡萄糖预先结合。*顶部，*跳跃蛋白质通过Western blot分析(*世界银行*)用anti-His₆显示10%输入的抗体。*底部，*输入Ponceau S染色蛋白质。定量分析表明，GST-Nef的捕获量增加了5.8倍他的₆PACS-1号机组_快堆和4.7倍以上他的₆PACS-2系列_快堆与GST-NefE4A相比。数据包括三个独立实验的代表。*B、，*H9型CD4细胞⁺T细胞与VV:PACS-1联合感染（m.o.i=3,8 h）或VV:PACS-2（m.o.i=5.8h）和VV:WT、VV:Nef/f或VV:NefE4A/f（m.oi=5、8小时）。FLAG标记的Nef蛋白被免疫沉淀(*IP（IP）*)、和免疫印迹法分析共沉淀PACS蛋白17703（PACS-1）或抗体18193（PACS-2）。量化显示Nef/f共沉淀的PACS-1是原来的3.7倍，PACS-2是原来的6.3倍NefE4A/f。

**图2。**
**Nef介导的MHC-I在原发性CD4中的下调**⁺ **T细胞需要PACS-1和PACS-2。** *A、，*初级人类CD4细胞⁺对从健康供体分离的T细胞进行核感染（Amaxa）带有对照siRNA(*可控硅*)或PACS-1或PACS-2特有的siRNA。在转染后72小时，收集细胞进行Western blot(*世界银行*)PACS蛋白(底部)或感染VV:WT或VV:Nef（m.o.i=10，隔夜）和细胞表面HLA-A2.1通过使用单克隆抗体BB7.1的流式细胞术(顶部). Nef的表达式如下在中插入对于每个图形。*B、顶部，*H9细胞是用pmaxGFP和对照siRNA或siRNA进行核感染（Amaxa）特定于PACS-1或PACS-2。转染后72小时，GFP⁺细胞通过FACS富集，然后感染VV:WT或VV:Nef（m.o.i=10，5 h），然后固定并用W6/32染色，以显示MHC-I下调监管。*比例尺*=20微米。*底部，*蛋白质印迹来自核感染细胞平行样品的裂解物。

**图3。**
**Nef-eYFP的核旁定位需要PACS-2。** *A、，*蛋白质印迹(*世界银行*)核感染HeLa细胞提取物（Amaxa）带有对照siRNA(*可控硅*)或PACS-1或PACS-2特有的siRNA。*B、，*中的单元格A类第二次用pNef-eYFP进行核感染(绿色). 转染后16小时，固定细胞，用Golgin 97、Rab9和TfR抗体，然后用荧光标记二级抗体(红色)，并由分析共焦显微镜。形态分析如下所述“实验程序。”*误差线*表示平均值和在五个独立实验中，每个标记20个细胞的S.D。*比例酒吧*=20微米。*C、，*未经处理的HeLa细胞或表达Nef-eYFP固定，抗-TfR染色，共焦分析显微镜检查。*比例尺*=20μm。

**图4。**
**Nef需要PACS-2来组装SFK-ZAP-70/Syk-PI3K级联。** *A、，*H9 CD4⁺细胞被核感染（Amaxa）(*可控硅*)siRNA或siRNA特定于PACS-1或PACS-2，在第1天和第3天。第5天，细胞感染了VV:WT或VV:Nef/f（m.o.i=10,8 h）。Nef是免疫沉淀的(*IP（IP）*)和联合免疫沉淀泰尔（P）²⁹²Western blot检测Zap70(*世界银行*). 这个Nef-相关PI3K活性的量按如下所述进行量化“实验程序。”*底部，*蛋白质印迹显示PACS-1、PACS-2和肌动蛋白的表达。*误差线*代表三个独立实验的平均值±S.D。*B、，*H9细胞在第1天转染表达p85α/f的质粒，p85αR₃₅₈A/f，p85αR₆₄₉A/f，或p85αRARA/f。第3天，细胞感染VV:WT（m.o.i=10,8h）或同时感染VV:Nef（未标记，m.o.i=10,8 h）和VV:Hck（m.o.i。=2,8小时）。收集细胞，并用FLAG标记p85α用单抗M2和共沉淀Tyr（P）免疫沉淀²⁹²ZAP-70型Western blot检测。数据代表两个独立的实验。*C、，*用siRNA转染H9细胞，如在A类第5天，细胞被VV:WT或VV:Nef/f共同感染（m.o.i=10，8小时）和VV:Hck（m.oi.=2，8 h）。Nef被免疫沉淀，Western blot检测共免疫沉淀Hck。数据包括三个独立实验的代表。*D、，*平行板H9 CD4的⁺细胞是否感染了VV:Nef/f（m.o.i=6每个）和VV:PACS-2ha（m.o.i=5每个），并且VV:WT的数量减少（m.o.i.英寸*车道2*= 14,*车道3*= 3,*车道4*=2，和*车道5*=1）或VV:Hck（m.o.i.英寸*车道4*= 1,*车道5*= 2,*车道6*=3；总m.o.i=14，18 h），并按规定收获根据“实验程序”。Nef/f通过免疫沉淀Western blot检测mAb M2、共沉淀Hck和PACS-2ha。*误差线*表示三个独立的平均值和S.D实验。

**图5。**
*包-2*基因敲除阻止Nef组装小鼠脾细胞中的SFK-ZAP-70/Syk-PI3K级联。 *A、，*从WT C57Bl/6或PACS-2分离的脾细胞^-/-C57Bl/6小鼠感染VV:WT或VV:Nef/f（m.o.i.=25，8h）。Nef被免疫沉淀(*IP（IP）*)，PI3K活性测量如下所述“实验程序”Western blot(*世界银行*)描述免疫沉淀Nef/f.表达Nef/f的复制免疫沉淀验证WT C57Bl/6脾细胞，并用0.1μ米PI-103、PIK-112或5μ米LY294002和Nef-相关PI3K测定了活性。*误差线*表示的平均值±S.D五个独立实验（共10只小鼠）。*B、，*初级脾细胞与WT或PACS-2隔离^-/-C57Bl/6小鼠被感染为中描述的A类Nef/f被免疫沉淀共免疫沉淀Tyr（P）³¹⁹Zap-70/Tyr（P）³⁵²Syk是Western blot检测。*C、，*从三个细胞中分离出的初级脾细胞成对的WT或PACS-2^-/-C57Bl/6小鼠同时感染VV:WT或VV:Nef/f（m.o.i=10，18小时）和VV:Hck（m.o.i=2，18 h）。Nef是Western检测到免疫沉淀和共免疫沉淀Hck污点。VV:WT感染样品中较低的m.o.i不会影响结果（见图。4D类).

**图6。**
**PACS-1和PACS-2介导内吞CD8-CIMPR的分选。**HeLa-CD8CIMPR细胞经核感染（Amaxa）并带有对照siRNA(*可控硅*)或特异于PACS-1或PACS-2的siRNA。48小时后，抗CD8（单抗UCHT-4，绿色)在37°C的温度下将其添加到培养基中1小时。这个取出培养基并用新鲜培养基替换30分钟细胞固定并用抗TfR染色(红色)然后是异形特异性荧光二级抗体。当时的细胞通过共焦显微镜观察。形态计量分析如下在“实验程序”中描述*误差线*代表八个独立标记中每个标记20个细胞的平均±S.D实验。*底部，*蛋白质印迹(*世界银行*)的裂解物核感染细胞的平行样本。*比例尺*=20微米。

**图7。**
**Nef-eYFP和内源性CI-MPR在PACS-2系列**^-^/^- **MEF公司。** *A、，*PACS-2系列^+/+和PACS-2^-/-MEF被转染（Amaxa）使用pNef-eYFP。18小时后，细胞固定并用抗甘露糖苷酶II或抗EEA1(红色)共焦显影显微镜检查。蛋白质印迹(*世界银行*)英寸*右上角*属于PACS-2裂解液中的PACS-2^+/+和PACS-2^-/-MEF是展示。*插入，*Nef-eYFP在分散的EEA1阳性隔间中PACS-2系列^-/-MEF公司。*B、，*PACS-2系列^+/+和PACS-2系列^-/-MEF转染（Amaxa）或不转染pGalT-CFP。18小时后，细胞固定，用抗EEA1染色(红色)或抗CI-MPR 8738(红色在GalT表达细胞中；绿色在里面EEA1共染细胞(底部))，并通过共焦显示显微镜检查。*插入，*EEA1阳性隔间中的CI-MPR。形态测量学按照“实验程序。”*误差线*表示20的平均值±S.DNef-eYFP的四个独立实验和三个独立实验中每个标记的细胞数CI-MPR的独立实验。*比例尺*=20微米。

**图8。**
**Nef需要PACS-2和I类PI3K来下调MHC-IMEF公司。** *A中，*蛋白质印迹(*世界银行*)的裂解物PACS-2型^+/+和PACS-2^-/-MEFs联合转染（Amaxa）pUHD10.1HLA-A2.1和pNef-eYFP。*B、，*48小时后，抗MHC-I（mAb W6/32，红色)在37°C的温度下将其添加到培养基中1小时。如果指示了用1μ米PI-103或PIK-112提前1小时抗体摄取，并且抑制剂保留在培养基中抗体摄取持续时间。在吸收后，媒体在不存在的情况下，取出并用新鲜培养基替换30分钟，或抑制剂的存在。细胞固定，荧光染色二级抗体，然后用共焦显微镜观察。*C、，*内化HLA-A2.1的形态计量学定量（W6/32）。金额内化抗体在WT或PACS-2中是相同的^-/-细胞单独转染pUHD10.1HLA-A2.1，因此使用相同的值用于正常化摄入*车道1*. The误差线表示三个标记中每个标记20个细胞的平均值±S.D独立实验。*比例尺*=20微米。

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