Stable isotopic labeling by amino acids in cultured primary neurons: application to brain-derived neurotrophic factor-dependent phosphotyrosine-associated signaling

doi:10.1074/mcp.M700387-MCP200

.2008年6月；7(6):1067-76.

doi:10.1074/mcp。M700387-MCP200。 Epub 2008年2月6日。

培养的原代神经元中氨基酸的稳定同位素标记：应用于脑源性神经营养因子依赖的磷酸酪氨酸相关信号

丹尼尔·斯佩尔曼¹, 凯特琳·戴哈德, Costel C Darie公司, 摩西五世·赵, 托马斯·诺伊伯特

附属公司

PMID： 18256212
预防性维修识别码：项目经理2424194
内政部： 10.1074/mcp。M700387-MCP200型

培养的原代神经元中氨基酸的稳定同位素标记：应用于脑源性神经营养因子依赖的磷酸酪氨酸相关信号

丹尼尔·斯佩尔曼等。分子细胞蛋白质组学. 2008年6月.

.2008年6月；7(6):1067-76.

doi:10.1074/mcp。M700387-MCP200。 Epub 2008年2月6日。

作者

丹尼尔·斯佩尔曼¹, 凯特琳·戴哈德, Costel C Darie公司, 摩西五世·赵, 托马斯·诺伊伯特

附属

¹美国纽约州纽约市纽约大学医学院Skirball生物分子医学研究所药理学系，邮编：10016。

PMID： 18256212
预防性维修识别码：项目经理2424194
内政部： 10.1074/mcp。M700387-MCP200型

摘要

培养的初级神经元是一种在体外研究神经元功能的成熟模型。在这里，我们证明了细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）可以应用于分化的、不分裂的细胞类型，如初级神经元，并且我们应用此技术评估神经元磷酸酪氨酸蛋白质组的变化，以响应脑源性神经营养因子（BDNF）的刺激，神经连接发育和调节的重要分子。我们发现，与BDNF处理的样品和对照样品相比，磷酸酪氨酸免疫沉淀中有13个蛋白质的SILAC比率高于1.50或低于0.67，另外18个蛋白质的比率高于1.25或低于0.80。这些蛋白质包括TrkB，BDNF的受体酪氨酸激酶，以及其他如肝细胞生长因子调节的酪氨酸激酶底物和信号转导适配器分子，这些蛋白质是已知的调节受体酪氨酸蛋白激酶细胞内运输的蛋白质。这些结果表明，原代神经元细胞培养和SILAC的结合可以成为研究神经元分子和细胞动力学蛋白质组的有力工具。

PubMed免责声明

数字

F<sc>ig</sc>。1 — **F类免疫球蛋白. 1.**
**原发性神经元SILAC实验设计。**在DIV 18时取出胚胎，解剖其大脑，并切除皮层和/或海马。然后将神经元分离并置于对照或标记培养基中，并允许加入标记10天。然后用配体处理细胞15分钟，并与来自同一解剖的未处理对照细胞1:1混合，然后进行Tyr（P）IP。通过SDS-PAGE对Tyr（P）IP洗脱液进行分级，并用凝胶中的胰蛋白酶进行消化，然后用LC-MS/MS分析胰蛋白酶消化液，以识别和量化这些存在的蛋白质。

F<sc>ig</sc>。2 — **F类免疫球蛋白. 2.**
**神经元蛋白的标记掺入百分比。**在多个时间点（1小时和1、2、3、4、5、7、14、21和28天）评估神经细胞全细胞裂解物中的蛋白质的标记掺入。圈子（•）代表观察到的标记掺入百分比最低的蛋白质，钻石(♦) 代表最高，以及*正方形*(▪) 用表示平均值*误差线*指示每个时间点所有测量的S.D。这个线是标签合并平均百分比的对数最佳拟合。1周后，所有定量蛋白质的标记率均大于70%*在体外*2周内>80%。

F<sc>ig</sc>。三。 — **F类免疫球蛋白. 3.**
**Western blot验证。**从SILAC实验所用的同一解剖中提取的皮层/海马神经元培养物，用BDNF处理不同时间。一对全细胞裂解物进行pY99和Trk-Western印迹。b条，pY99IP的裂解物，如一然后是已知和潜在新TrkB信号参与者的特异性蛋白印迹。在BDNF刺激15分钟后测量来自受刺激细胞和未受刺激细胞的Tyr（P）IP的SILAC比率，以进行比较。*FAK（传真）*，粘着斑激酶；*Hc公司*、重链；第页，磷酸酪氨酸。

F<sc>ig</sc>。4 — **F类免疫球蛋白. 4.**
**增强Hrs-STAM相互作用和Hrs磷酸化。** 一Western blot检测BDNF处理的皮层/海马神经元培养物的Hrs和STAM。这些结果表明，Hrs和STAM之间的相关性呈BDNF依赖性增加。b条，通过Hrs IP洗脱液的Tyr（P）Western blotting监测BDNF依赖的Hrs磷酸化。第页，磷酸酪氨酸。

F<sc>ig</sc>。5 — **F类免疫球蛋白. 5.**
**Hrs和pTrkB的共定标。**神经元培养物的免疫荧光和共焦显微镜显示，BDNF治疗15分钟后，Hrs和pTrkB在囊泡结构中共同定位(一). 这种共定位可以在两个细胞体中观察到(*顶部面板*)和神经突起(*底部面板*).白色箭头指出共同本地化的实例。b条BDNF处理15分钟后，额外的免疫荧光显示Hrs、pTrkB和EEA1（早期内体的标记物）共同定位。*白色箭头*在放大的图像中(*右下面板*)指出三重共定位的位置。

F<sc>ig</sc>。6 — **F类免疫球蛋白. 6.**
**Hrs的过度表达。**瞬时转染HA-Hrs的神经元培养物的免疫荧光和共焦显微镜(+面板)或不（−面板)已执行。之后对饥饿的细胞进行成像(*左两行*属于面板)或不带(*右两行*属于面板)BDNF处理4小时。转染和未转染的图像细胞出现在同一张载玻片上，并带有单独的载玻片用于对照和BDNF模拟条件。总Trk染色减少(红色)BDNF处理4小时后，可在对照细胞中观察到(*4小时BDNF*−面板). HA-Hrs的过度表达(绿色)导致Trk降解中断(*4小时BDNF*+面板).驾驶员信息中心差分干涉对比度。

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1. Alberts，B.（2002）《细胞分子生物学》，第4版，第472页，纽约加兰科学出版社
1. Silva，R.F.、Falcao，A.S.、Fernandes，A.、Gordo，A.C.、Brito，M.A.和Brites，D.（2006）分离原代神经细胞培养物作为神经毒性评估模型。毒性。莱特。163, 1–9-公共医学
1. Matteoli，M.、Verderio，C.、Krawzeski，K.、Mundigl，O.、Coco，S.、Fumagalli，G.和De Camilli，P.（1995）初级培养海马神经元突触发生的机制。《生理学杂志》。（巴黎）89，51–55-公共医学
1. Lindsley，T.A.、Kerlin，A.M.和Rising，L.J.（2003）乙醇对体外轴突生长影响的时间推移分析。大脑研究开发大脑研究147、191–199-公共医学
1. Ong，S.E.、Blagoev，B.、Kratchmarova，I.、Kristensen，D.B.、Steen，H.、Pandey，A.和Mann，M.（2002）细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记，SILAC，作为一种简单而准确的表达蛋白质组学方法。分子细胞。蛋白质组学1，376–386-公共医学

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[1] Alberts，B.（2002）《细胞分子生物学》，第4版，第472页，纽约加兰科学出版社

[2] Alberts，B.（2002）《细胞分子生物学》，第4版，第472页，纽约加兰科学出版社

[3] Silva，R.F.、Falcao，A.S.、Fernandes，A.、Gordo，A.C.、Brito，M.A.和Brites，D.（2006）分离原代神经细胞培养物作为神经毒性评估模型。毒性。莱特。163, 1–9-公共医学

[4] Silva，R.F.、Falcao，A.S.、Fernandes，A.、Gordo，A.C.、Brito，M.A.和Brites，D.（2006）分离原代神经细胞培养物作为神经毒性评估模型。毒性。莱特。163, 1–9-公共医学

[5] Matteoli，M.、Verderio，C.、Krawzeski，K.、Mundigl，O.、Coco，S.、Fumagalli，G.和De Camilli，P.（1995）初级培养海马神经元突触发生的机制。《生理学杂志》。（巴黎）89，51–55-公共医学

[6] Matteoli，M.、Verderio，C.、Krawzeski，K.、Mundigl，O.、Coco，S.、Fumagalli，G.和De Camilli，P.（1995）初级培养海马神经元突触发生的机制。《生理学杂志》。（巴黎）89，51–55-公共医学

[7] Lindsley，T.A.、Kerlin，A.M.和Rising，L.J.（2003）乙醇对体外轴突生长影响的时间推移分析。大脑研究开发大脑研究147、191–199-公共医学

[8] Lindsley，T.A.、Kerlin，A.M.和Rising，L.J.（2003）乙醇对体外轴突生长影响的时间推移分析。大脑研究开发大脑研究147、191–199-公共医学

[9] Ong，S.E.、Blagoev，B.、Kratchmarova，I.、Kristensen，D.B.、Steen，H.、Pandey，A.和Mann，M.（2002）细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记，SILAC，作为一种简单而准确的表达蛋白质组学方法。分子细胞。蛋白质组学1，376–386-公共医学

[10] Ong，S.E.、Blagoev，B.、Kratchmarova，I.、Kristensen，D.B.、Steen，H.、Pandey，A.和Mann，M.（2002）细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记，SILAC，作为一种简单而准确的表达蛋白质组学方法。分子细胞。蛋白质组学1，376–386-公共医学

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