Bcl-xL induces Drp1-dependent synapse formation in cultured hippocampal neurons

doi:10.1073/pnas.0711647105

.2008年2月12日；105(6):2169-74.

doi:10.1073/pnas.0711647105。 Epub 2008年2月4日。

Bcl-xL诱导培养海马神经元依赖Drp1的突触形成

李红梅¹, 陈应北, 阿德里安·琼斯, 理查德·桑格, 利昂·P·科利斯, 理查德·弗兰纳里, 伊万·C·麦克奈, 汀溪语, 罗伯特·施瓦岑巴赫, 布莱斯·博西, 埃拉·博西·韦策尔, 迈克尔·V·L·贝内特, 马克·皮帕特, 约翰·A·希克曼, 彼得·J·S·史密斯, 玛丽·哈德威克, 伊丽莎白·A·乔纳斯

附属公司

PMID： 18250306
预防性维修识别码：项目经理2542873
内政部： 10.1073/pnas.0711647105

Bcl-xL诱导培养海马神经元依赖Drp1的突触形成

李红梅等。美国国家科学院程序. 2008.

.2008年2月12日；105(6):2169-74.

doi:10.1073/pnas.0711647105。 Epub 2008年2月4日。

作者

附属

¹耶鲁大学医学院内科，地址：333 Cedar Street，New Haven，CT 06520，USA。

PMID： 18250306
预防性维修识别码：项目经理2542873
内政部： 10.1073/pnas.0711647105

摘要

神经元突触的成熟被认为与线粒体有关。Bcl-xL蛋白抑制线粒体介导的凋亡，但在Bcl-xL丰富的健康成年神经元中可能具有其他功能。在这里，我们报道了Bcl-xL突触后过度表达会增加培养的大鼠海马神经元自发微型突触电流的频率和幅度。Bcl-xL在突触前或突触后过度表达，增加突触数量、突触囊泡簇的数量和大小，以及线粒体定位于囊泡簇和突触，这可能是微型突触电流变化的原因。相反，Bcl-xL的敲除或ABT-737的抑制会降低这些形态学参数。线粒体分裂蛋白，动力蛋白相关蛋白1（Drp1），是一种已知定位于突触并影响突触功能和结构的GTP酶。Bcl-xL的作用似乎是通过Drp1介导的，因为Drp1的过度表达会增加突触标记，而显性负性dnDrp1-K38A的过度表达则会降低突触标记。此外，Bcl-xL与Drp1在组织裂解物中共免疫沉淀，在重组系统中，Bcl-xL蛋白刺激Drp1的GTPase活性。这些发现表明，Bcl-xL正调控Drp1，以刺激突触形成的方式改变线粒体功能。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
Bcl-x公司_L（左）改变神经递质的自发释放。(A类)转染Mito-GFP（对照）或GFP-Bcl-x的大鼠海马神经元（DIV5）自发mEPSCs和mIPSC在−70 mV下的代表性记录_L（左）. (B类)所有实验的mEPSC和mIPSC的记录和量化振幅，如A类（第17部分）(n个=GFP-Bcl-x的6个细胞_L（左）;n个=8（对于Mito-GFP）。(C类)所有实验事件之间的量化间隔。*，*P（P）*<0.05，由学生确定t吨测试。

**图2。**
Bcl-x公司_L（左）诱导培养海马神经元形成突触。(A类)与Mito-RFP（红色）和GFP-Bcl-x共转染（DIV5）的培养海马神经元轴突（DIV13）的荧光显微镜观察_L（左）（绿色）和两个图像的合并。(B类和C类)转染神经元轴突中突触素的免疫荧光显微镜检查。用平均值±SEM表示轴突相对荧光单位（rfu）中puncta的荧光强度及其单位长度（≈35μm）的数目n个=三个独立实验中每组15个神经元。*，*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*<0.01，学生的t吨测试。(D类和E类)巴松管的免疫荧光显微镜B类和C类. (F类和*G公司*)PSD-95的免疫荧光显微镜B类和C类. (*H（H）*和我)转染神经元树突旁突触素点的免疫荧光显微镜观察B类和C类.突触的形成很可能发生在*H（H）*，但树突可能存在于B类,D类、和F类.

**图3。**
Bcl-x公司_L（左）是突触形成所必需的。(A类)免疫荧光显微镜检测未转染海马神经元（DIV14）轴突中突触素，DIV5处添加或不添加1μM ABT-737。数据量化如图2所示C类用于三个独立实验(n个=每组6个细胞）。*，*P（P）*< 0.05; ***,*P（P）*<0.001，学生t吨测试。白点表示轴突的走向。(B类)转染（DIV5）的海马神经元（DIV14）轴突中突触素的免疫荧光显微镜观察*bcl-x公司*发夹RNA（pCAG-lacZ-shRNA-Bcl-x_L（左）)或控制向量（pCAG-lacZ）。对三个独立实验中的突触体素强度（rfu）和每20μm轴突的突起数量进行了量化（平均值±SEM；n个=每组12个神经元）。*，*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01; ***,*P（P）*<0.001，学生t吨测试。

**图4。**
Bcl-x公司_L（左）增加单位长度轴突的线粒体数量及其与突触前部位的共定位。(A类)海马培养物中转染轴突的荧光显微镜用MitoTracker Red染色。神经元要么按指示转染，要么用ABT-737处理（两者均用DIV5）。轴突图像旁边的白点显示轴突轨迹。对对照组和ABT-737组每6μm轴突的线粒体线粒体数量（平均值±SEM）进行量化(n个=每组6个神经元）和GFP-Bcl-x_L（左）(n个=总共15个神经元的三个独立实验中的每一个都是5）。*，*P（P）*< 0.05; ***,*P（P）*< 0.001. (B类)通过仅表达GFP或GFP-Bcl-x的神经元（DIV13）之间的突触密度确定的突触轮廓的代表性电子显微图_L（左）数据量化*C–E类*.V，囊泡；SD，突触密度；M、线粒体。（比例尺：500 nm。）(C类)包含线粒体的突触轮廓的百分比。(D类)每个突触轮廓的小泡数。(E类)如果存在线粒体并且神经元表达GFP-Bclx，则每个突触轮廓的囊泡数量更大_L（左）. *,*P（P）*< 0.05; ***,*P（P）*< 0.001.

**图5。**
Bcl-x的Drp1-相关函数_L（左）突触形成和线粒体定位。(A类)定量免疫荧光强度（rfu，左侧)以及每20μm轴突突触素点的数量（平均值±SEM，赖特)用于图2所示的三个独立实验(n个=每组共12个神经元）。*，*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*与Mito-GFP对照组相比<0.01，Student’st吨测试。Mito-GFP和GFP-Bcl-x差异的意义_L（左）还指示了每个带有dnDrp1-K38A的。(B类)三个独立实验中每6μm轴突的线粒体数量（平均值±SEM；n个=每组10个神经元）。*，*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01; ***,*P（P）*<0.001，学生t吨测试和比较A类. (C类)定量免疫荧光法检测转染Drp1-HA（DIV5）和/或ABT-737（DIV 5）的海马神经元（DIV13）每20μm轴突的突触素强度（rfu）和突触点数量以及每6μm轴轴突的线粒体数量（平均值±SEM，n个=三个独立实验中每组6个细胞）。*，*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01; ***,*P（P）*与对照组相比<0.001。

**图6。**
Bcl-x公司_L（左）和Drp1相互作用。(A类) (顶部和中部)用病毒载体（DIV5）转导的海马神经元（DIV13）相互共免疫沉淀实验的免疫印迹(n个= 2). 指示用于沉淀（IP）和免疫印迹的抗体。(顶部)Drp1与GFP-Bcl-x共沉淀_L（左）被GFP抗体击倒。(底部)上述免疫沉淀起始裂解物中的内源性Drp1斑点。(B类)内源性Bcl-x的免疫印迹_L（左）和成年大鼠脑内内源性Drp1经免疫沉淀后显示抗体。每个面板显示起始裂解物、控制IgG沉淀物以及用Drp1和Bcl-x探测的指示沉淀物_L（左）抗体。(C类)GTPase活性在1小时内与纯化的重组蛋白产生的磷酸盐的相对量。显示了三个独立实验的结果（平均值±SEM）。BSA在背景以上没有GTPase活性，并且从其他值中减去该信号。***，*P（P）*< 0.001. (D类)Bcl-x型号_L（左）-诱导突触功能。黑色箭头表示本工作中解决的步骤。

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