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.2008年2月19日；117(7):952-62.
doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.107.744490。 Epub 2008年2月4日。

蛋白激酶C-zeta对丝氨酸428处LKB1的磷酸化是二甲双胍增强内皮细胞AMP活化蛋白激酶活化所必需的

谢忠林 1, 云州洞, 罗兰·舒尔茨, 迪伯特·诺依曼, 邹明辉
附属机构

蛋白激酶C-zeta对丝氨酸428处LKB1的磷酸化是二甲双胍增强内皮细胞AMP活化蛋白激酶活化所必需的

谢忠林等人。 循环. .

摘要

背景：二甲双胍是最常用的抗糖尿病药物之一，据报道它通过激活AMP-活化蛋白激酶（AMPK）发挥其治疗作用；然而，二甲双胍激活AMPK的机制尚不明确。本研究的目的是确定二甲双胍如何激活内皮细胞中的AMPK。

方法和结果：将人脐静脉内皮细胞或牛主动脉内皮细胞暴露于二甲双胍后，AMPK活性显著增加，Thr172处的AMPK和Ser428处的LKB1磷酸化，这是一种AMPK激酶，与蛋白激酶C（PKC）-zeta的活化增加平行，如活性增加所示，磷酸化（Thr410/403）和PKC-zeta的核移位。一贯地，PKC-zeta的药理学或基因抑制消融二甲双胍都会增强AMPK-Tr172和LKB1-Ser428的磷酸化，这表明PKC-zeta可能是LKB1的上游激酶。此外，腺病毒过度表达LKB1激酶突变体消除了LKB1野生型过度表达，但增强了二甲双胍对牛主动脉内皮细胞AMPK的影响。此外，二甲双胍增加了牛主动脉内皮细胞中LKB1的磷酸化和核向胞浆的输出，以及AMPK与LKB1之间的联系。类似地，LKB1野生型而非LKB1 S428A突变体的过度表达（丝氨酸被丙氨酸取代）恢复了二甲双胍对LKB1缺陷HeLa-S3细胞中AMPK的作用，这表明二甲双胍-增强AMPK激活需要LKB1的Ser428磷酸化。此外，LKB1 S428A与激酶头LKB1 D194A一样，在HeLa-S3细胞中消除了二甲双胍增强的LKB1易位以及LKB1与AMPK的关联。最后，抑制PKC-zeta可消除二甲双胍增强的LKB1与AMPKalpha1和AMPKalphi2的共免疫沉淀。

结论：我们得出结论，PKC-zeta在Ser428磷酸化LKB1，导致LKB1核输出，从而激活AMPK。

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数字

图1
图1
PKC的抑制-ζ减弱二甲双胍增强的AMPK活性。汇合的BAEC或HUVEC，无论是否感染腺病毒，均与PKC预孵育-ζ-暴露于二甲双胍前，PS 30分钟。处理后，对细胞进行裂解和提取。如方法中所述，磷酸化AMPK-Tr172和ACC-Ser79均通过使用特定抗体在蛋白质印迹中检测到。A、 二甲双胍（Met）激活BAEC和HUVEC中的AMPK。该印迹是从6个单独实验中获得的6个印迹的代表。Con表示控制。B和C，选择性抑制PKC-ζ二甲双胍减弱增强AMPK活性（n=6）。♣P（P）<0.05（对照组[Con]与二甲双胍治疗组），†P（P）<0.05（二甲双胍vs二甲双胍加PKC-ζ-PS）。D、 PKC公司-ζ-PS剂量依赖性地抑制BAEC中二甲双胍增强的AMPK活性（n=5）。♣P（P）<0.05（对照组vs二甲双胍），†P（P）<0.05（二甲双胍vs二甲双胍加PKC-ζ-PS）。E和F，PKC的遗传抑制-ζ带PKC-ζ-DN，而不是编码GFP的腺病毒-rus，减弱了二甲双胍增强的BAEC中AMPK-Tr172和ACC-Ser79的磷酸化。该斑点代表了5个单独实验中的5个斑点（n=5）。♣P（P）<0.05（与对照组相比），†P（P）<0.05（二甲双胍治疗组与二甲双胍加腺病毒组）。G、 AMPK活性按方法（n=4）所述进行测定。♣P（P）<0.05（与对照组相比），†P（P）<0.05（二甲双胍治疗组与二甲双胍加腺病毒组）。
图2
图2
二甲双胍增加PKC-ζ磷酸化与PKC转位-ζ从胞浆到膜。汇合BAEC暴露于二甲双胍（1 mmol/L，1小时），PKC移位-ζ和PKC-ζ磷酸化按方法所述进行测定。A、 二甲双胍（Met）增加PKC的磷酸化-ζ在BAEC。该印迹是从3个独立实验中获得的3个印迹的代表。Con表示控制。B、 PKC公司-ζ按照方法（n=4）所述测定活性。♣P（P）<0.05（与对照组相比[Con]），†P（P）<0.05（二甲双胍治疗组与二甲双胍加腺病毒组）#P（P）<0.05（PKC-ζ-WT与二甲双胍加WT腺病毒）。C和D，二甲双胍增加PKC的易位-ζ到膜（n=5）。♣P（P）<0.05（对照组与二甲双胍治疗组）。E和F，二甲双胍增加PKC的易位-ζ从细胞溶质进入细胞核。该印迹是来自3个单独实验的3个印迹的代表（n=5）。♣P（P）<0.05（对照组与二甲双胍治疗组）。G、 亚细胞组分纯度分析。按照方法中所述制备亚细胞级分。用特异性抗体通过Western blot检测标记酶。
图3
图3
PKA和RSK均不参与二甲双胍增强BAEC中AMPK的激活。A和B，汇合BAEC用蛋白激酶抑制剂预处理30分钟，然后用二甲双胍（1 mmol/L）处理1小时，裂解细胞，Western blot检测AMPK和LKB1的磷酸化。该斑点是来自3个不同实验的斑点的代表。♣P（P）与相应对照组（Con）相比<0.05。C、 用二甲双胍（Met）（1 mmol/L）处理BAEC 1小时，制备细胞裂解物，PKC磷酸化-ζ使用特异性抗体通过Western blot检测PKAc和RSK3。该印迹是从3个单独实验中获得的3个印迹的代表。D、 LKB1免疫沉淀，PKC-ζWestern blotting检测到PKAc和RSK3。该斑点代表了3个不同实验的斑点。E、 用PKC转染融合的BAEC-ζ-DN和PKC-ζ-WT腺病毒治疗48小时，二甲双胍治疗1小时。裂解细胞并通过蛋白质印迹进行分析。该印迹是从3个单独实验中获得的3个印迹的代表。
图4
图4
PKC公司-ζ丝氨酸428处LKB1的依赖性LKB1磷酸化。A和B，二甲双胍激活的AMPK在BAEC中依赖LKB1。激酶头LKB1突变体的腺病毒过度表达阻断二甲双胍诱导的AMPK激活，而LKB1 WT过度表达增强了LKB1在BAEC中的作用。该印迹是来自5个独立实验的5个印迹的代表。C和D，二甲双胍增强的丝氨酸428的LKB1磷酸化是PKC-ζ依赖。该印迹是来自5个独立实验的5个印迹的代表（n=5）。♣P（P）<0.05（对照组[Con]vs二甲双胍），†P（P）<0.05（二甲双胍vs二甲双胍加PKC-ζ腺病毒）。E、 LKB1活性按照方法（n＝4）中所述进行测量。F和G，PKC的时间进程-ζ、LKB1和AMPK磷酸化。用二甲双胍（1 mmol/L）处理BAEC，PKC磷酸化-ζWestern blot分析在指定时间检测LKB1和AMPK。该斑点是来自3个单独实验的3个斑点的代表*♣†P（P）与相应对照组相比，<0.05。
图5
图5
二甲双胍增加了LKB1从细胞核到HUVEC胞浆的转运。A、 二甲双胍引起的HUVEC中LKB1从细胞核向胞浆移位的免疫细胞化学染色。B和C，二甲双胍（Met）也会增加胞浆中LKB1的数量，而降低HUVEC细胞核中LKB1。该印迹是从5个独立实验中获得的5个印迹的代表。Con表示控制。D和E，二甲双胍增加细胞核和细胞质中LKB1的丝氨酸428磷酸化。该印迹是从3个独立实验中获得的3个印迹的代表。
图6
图6
二甲双胍增强LKB1易位和AMPK活化需要LKB1-Ser428的磷酸化。A、 二甲双胍（Met）免疫细胞化学染色增强A549细胞LKB1易位。按照方法中的描述，用指定的质粒转染细胞。使用小鼠抗His Tag抗体检测LKB1。由于转染Lac-Z的A549细胞与抗体没有反应，因此省略了Lac-Z图像。Con表示控制。B、 A549细胞LKB1的Western blot检测。该印迹是来自5个独立实验的5个印迹的代表（n=5）。♣P（P）<0.05（WT vs WT加二甲双胍），†P（P）<0.05（WT加二甲双胍vs WT或S428A加二甲双双胍）。
图7
图7
二甲双胍增强的AMPK激活和LKB1与AMPK的共免疫沉淀需要LKB1的Ser428磷酸化。A和B，二甲双胍在HeLa-S3过度表达LKB1-WT而非LKB1-Ser428A突变体中激活AMPK。HeLa-S3细胞转染LKB1-WT或激酶缺失型LKB1突变体或LKB1-Ser428A突变体后，暴露于二甲双胍（1 mmol/L，1小时）。使用特异性抗体在Western blots中监测AMPK激活。该印迹是来自5个独立实验的5个印迹的代表。C、 ONOO需要LKB1的Ser428磷酸化−-增强AMPK激活。在转染LKB1-WT或LKB1-Ser428A（Ser428突变为丙氨酸，功能丧失）或LKB1-Ser428D（Ser428被天冬氨酸取代，磷酸化模拟）后，HeLa-S3细胞暴露于ONOO−(100μ摩尔/升）。使用特异性抗体通过Western blotting监测AMPK激活。该印迹是来自5个独立实验的5个印迹的代表。D、 LKB1 WT或LKB1-Ser431A突变体中的LKB1活性。E、 二甲双胍增加LKB1和AMPK的结合。从BAEC中免疫沉淀LKB1，在Western blot中检测到AMPK。PKC的抑制-ζ减毒二甲双胍增强LKB1与AMPK的相关性。该印迹是来自5个独立实验的5个印迹的代表。F、 LKB1的Ser428突变为丙氨酸（S428A）消除了二甲双胍增强的LKB1与AMPK的共免疫沉淀。二甲双胍增加了LKB1与LKB1 WT的共免疫沉淀，但不增加LKB1突变体的共免疫沉积。该斑点是来自3个单独实验的3个斑点的代表。
图8
图8
二甲双胍增强AMPK激活需要LKB1核输出。在静息状态下，LKB1主要位于细胞核中，而LKB1的活性需要连接蛋白MO25和STRAD以及AMPK-α1（内皮细胞中AMPK催化单位的主要亚型）位于胞浆中。二甲双胍（或ONOO−)激活PI-3激酶，导致PDK-1/2磷酸化。PDK-1/2磷酸化PKC-ζ导致后者移位到细胞核和细胞质膜。在细胞核中，激活了PKC-ζ在丝氨酸428和可能的其他位点磷酸化LKB1。磷酸化的LKB1通过一种未知机制从细胞核输出到胞浆。LKB1随后与先前存在的适配器蛋白（STRAD和MO25）结合，后者在Thr172处招募和磷酸化AMPK。AMPK也可能被其他刺激物激活，这些刺激物要么激活PKC-ζ或增加LKB1-Ser428磷酸化（PKA或RSK90）。总之，我们的结果表明PI-3激酶-PDK1/2-PKC-ζ该通路在二甲双胍增强AMPK激活中起着关键作用。
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    1. Abbasi F，Chu JW，McLaughlin T，Lamendola C，Leary ET，Reaven GM。二甲双胍治疗对2型糖尿病患者多种心血管疾病危险因素的影响。新陈代谢。2004;53:159–164.-公共医学
    1. Verma S、Yao L、Dumont AS、McNeill JH。二甲双胍治疗可纠正高血压患者的血管胰岛素抵抗。高血压杂志。2000;8:1445–1450。-公共医学
    1. Kataka PV、Ujhelyi MR、Hoenig M、Miller AW。二甲双胍改善胰岛素抵抗大鼠的血管功能。高血压。2000;35:108–112.-公共医学
    1. Marfella R、Acampora R、Verrazzo G、Ziccardi P、De RN、Giunta R、Giugliano D.二甲双胍改善NIDDM患者对L-精氨酸的血流动力学和流变学反应。糖尿病护理。1996;19:934–939.-公共医学

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