Pivotal roles for eomesodermin during axis formation, epithelium-to-mesenchyme transition and endoderm specification in the mouse

doi:10.1242/dev.014357

.2008年2月；135(3):501-11.

doi:10.1242/dev.014357。 Epub 2008年1月2日。

小鼠中胚层蛋白在轴形成、上皮-间充质转化和内胚层规范中的关键作用

塞巴斯蒂安·阿诺德¹, 乌尔夫·霍夫曼, 伊丽莎白·K·比科夫, 伊丽莎白·罗伯逊

附属公司

PMID： 18171685
预防性维修识别码：项目管理委员会7116389
内政部： 10.1242/dev.014357

在小鼠中轴形成、上皮-间充质转化和内胚层规范过程中，始中胚层蛋白的关键作用

塞巴斯蒂安·阿诺德等。开发. 2008年2月.

.2008年2月；135（3）：501-11。

doi:10.1242/dev.014357。 Epub 2008年1月2日。

作者

塞巴斯蒂安·阿诺德¹, 乌尔夫·霍夫曼, 伊丽莎白·K·比科夫, 伊丽莎白·罗伯逊

附属

¹英国牛津OX1 3RE牛津大学南帕克斯路威廉·邓恩爵士病理学院。

PMID： 18171685
预防性维修识别码：项目管理委员会7116389
内政部： 10.1242/dev.014357

摘要

T盒转录因子中胚层蛋白（Eomes）被认为是脊椎动物胚胎生殖层诱导和模式化的重要组成部分。在小鼠中，Eomes对滋养层谱系的发育至关重要，而Eomes功能丧失突变体在植入时停止。在这里，我们使用了一个新的Eomes条件等位基因来测试胚胎本身的Eome功能。Eomes缺陷胚胎在正常水平上表达Fgf8及其下游靶标蜗牛，但令人惊讶的是未能下调E-cadherin。Eomes功能丧失因此有效且深刻地阻止了EMT和伴随的中胚层分层。标记分析、命运定位和嵌合体研究首次证明，Eomes是确定内胚层谱系所必需的。我们还描述了Eomes/Nodal双杂合子的发育异常，并证明这些表型反映了不同组织部位的Eomes和Nodal相互作用。总之，我们的实验证明Eomes是小鼠前后轴形成、EMT和明确内胚层规范的关键调节器。

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数字

图1
Cre介导切除一个新的*脱中胚蛋白*条件等位基因结果在一个空突变中。(A类)有条件地停用*脱中胚蛋白*，编码Tbox结构域的外显子2-5两侧LoxP站点（蓝色箭头）和LoxP侧翼的可选标记(*PGK.湿度计）*在内含子5-6中介绍。ES细胞克隆通过Southern blot在*Ncol公司*-消化的DNA和5′LoxP现场的存在于*Xbal公司*-消化的DNA如图所示。(B类)正确定向的克隆受到Cre重组酶的瞬时表达。(C类)*印地语*II消化的DNA通过Southern blot分析以检测各种配置。绿色箭头代表PCR的起始位点基因分型。(D类)培养的囊胚来自*脱中胚蛋白* ^N个/+72年后对交叉进行分析小时。鉴于野生型和*脱中胚蛋白* ^N个/+杂合的囊胚发育出具有典型巨细胞的滋养层细胞（箭头所示），*脱中胚蛋白* ^无胚泡不能形成外生长（一）或显示巨细胞数量严重减少（II）。(E类)用引物对断奶龄小鼠尾部DNA进行多重PCR分型如B所示，表明*脱中胚蛋白* ^CA/CA公司和*脱中胚蛋白* ^CA/N公司动物。H、，*印地语*二;血红蛋白，*HpaI；*Nc中，*Ncol公司*; Sa、，*Sa公司*d；X、，*Xbal公司*.

图2
表晶特异性*脱中胚蛋白*缺失阻断原肠胚形成原始条纹阶段。(**A-F公司**)整体原位杂交带有AVE的分子标记(*十六进制*和*证书1*)和后部外胚层(*重量3*)在E6.5显示了正确的AP轴规格*脱中胚蛋白* ^{不适用于CA};*Sox2.Cre公司*突变体胚胎。(**G-H’**)在E7.5，*脱中胚蛋白*外胚层突变体显示出外胚层明显的后部增厚，并且缺乏中胚层组织层如组织切片所示。(我，J型)后部（短肢*/运动内衣*)以及(**K-N公司**)中间物(*混合物1，Tbx6*)条纹标记以*脱中胚蛋白*外胚层突变体，但节点由于缺乏嘘表达(**O（运行）**，**P（P）**)。(问，**R（右）**)一致扫描电子显微镜显示，在突变胚胎的末端（方框区域表示节点形成区域）。(**S公司**，T型)相反*其他2*表达式域在中展开*脱中胚蛋白*突变体。(**U-X型**)DE标记的E7.5表达*证书1*和AME标记*福克斯2*迷失方向(年，Z轴)VE标记的表达*法新社*不能局限于胚胎外区域。

图3
Eomes突变的外胚层细胞不能参与内胚层。外胚层通孔的命运图分析*Sox2.Cre公司*和俄罗斯26^R（右）报告基因显示外胚层（箭头）覆盖在胚胎上(**A-A“**)E7.75控制胚胎完全来源于ROSA26阳性的外胚层细胞。(**B-B“**)*脱中胚蛋白* ^{不适用于CA};*Sox2.Cre公司*; 俄罗斯26^对/+突变体外胚层细胞失败有助于内胚层（箭头）。偶尔，单身*lacZ公司*-在内胚层中发现阳性细胞，大多数可能是由于来自*Sox2.Cre公司*转基因。

图4
*埃姆斯-*缺乏外胚层表现正常*Fgf8/蜗牛*表达，但未能下调E-cadherin。(A类)横截面扫描电子显微镜E7.5控制和*脱中胚蛋白*突变胚胎显示间充质突变胚原始条纹处积累的细胞形态。*脱中胚蛋白*突变体缺乏中胚层细胞层。(B类)使用抗E-钙粘蛋白的免疫荧光染色E7.5中的抗体*脱中胚蛋白*突变胚胎显示PS期E-cadherin下调。而野生型胚胎的中胚层没有E-cadherin（箭头），突变体中独特的组织块保留E-cadherin(C类，D类)*Fgf8型*和蜗牛在适当的位置表达，正常强度in脱中胚蛋白 ^不适用;*Sox2.Cre公司*通过全山原位杂交（C）或原位杂交分析的胚胎截面（D）上的杂交。突变体PS显示重叠表达E-钙粘蛋白和蜗牛，而在野生类型中控制表达域是互斥的。（C） Fgf靶*喷洒2*广泛表达于*脱中胚蛋白*突变体。(E类)野生型和*脱中胚蛋白*突变原语条状外植体培养显示出难以区分的迁移行为和有效下调迁移细胞中的E-cadherin。虚线表示E-cadherin阳性外植体的边界。

图5
细胞自主*脱中胚蛋白*从原始条纹和内胚层规格。(A类)*埃姆斯-*通过重新定位剩余野生型等位基因*脱中胚蛋白* ^N个/+杂合的ES细胞。(B类)*脱中胚蛋白* ^无ES细胞引入ROSA26^LacZ公司囊胚，如图所示和嵌合体胚胎在E7.5时的组织学分析(**C-G公司**)和E9.5(**氢-氮**)。（C-G）/*acZ公司*-阴性*脱中胚蛋白* ^无ES细胞（用曙红复染）随机分布在E7.5（C′，D-G）的外胚层中，但失败退出PS并在羊膜腔内的细胞团中积聚。（H）高度E9.5的嵌合体胚胎发育延迟，表现出相对不足中胚层衍生物，导致影响心脏的严重异常，体节、轴伸长和胚胎转向。（识别号）*脱中胚蛋白* ^不适用突变的ES细胞不能参与明确的内胚层衍生物，在任何情况下都无法在肠管内找到水平（H-N中的箭头）。（N）嵌合体胚胎偶尔表现为后部神经管复制（箭头）。

图6
受到严重影响*脱中胚蛋白* ^N个/+; 节点^LacZ公司/+双杂合子不能旋转PD轴。(A类，A’)结节表达正常受限E6.5处的后部外胚层(B类，B’)持续存在于*脱中胚蛋白* ^N个/+ *;节点* ^LacZ公司/+双杂合胚胎。(**首席财务官**)AVE标记(*十六进制*和*证书）*保持局限于双胎的远端杂合突变胚胎。(**G-L公司**)因此后标记基因（cripto，*脱中胚蛋白*和brachyury）贯穿始终近端外胚层。(**M（M）**，N个)*特殊用途4*是在突变胚胎的ExE中以正常水平表达近距离移位。(**O-P’**)从原肠胚形成晚期此外，双杂合突变体显示出生殖层的严重干扰骨髓中间充质细胞的形成和大量细胞堆积羊膜腔（P′箭头，*lacZ公司*染色）和胚胎和胚胎外区域之间的严重收缩胚胎（P中的箭头）。(**Q-T（质量-温度）**)在E7.5处，中胚层标记*Fgf8型*在突变体中广泛表达，而*证书1*标志着新形成的DE，未能表达。

图7
第二类*脱中胚蛋白* ^N个/+; 节点^LacZ公司/+双杂合子突变体不能指定前部原始条纹和显示部分轴复制。化合物的比例杂合胚胎正确指定AP轴，但表现出表达减少DE标记(A类，B类)*十六进制*和(**C-D’**)*Cer1型*在E6.5和E7.5，分别是。前轴中线组织丢失，如图所示(E类，F类)前截短表达PS（星号）和(**G-H’**)缺少嘘（箭头表示节点中剩余的表达式）。（H，H’）头部褶皱在突变胚胎中存在E8.0（星号），但(我，J型)前神经同一性与Otx2表达E8.5时丢失。(**K-N公司**)在E9.5处，双杂合突变体出现严重的前部截断和不同程度的心脏缺损，包括（L）环状缺陷（箭头）至（N）伴有贲门裂的严重畸形，而后天发育仍然没有受到明显影响。(**O（运行）**，**P（P）**)一部分*脱中胚蛋白* ^N个/+ *;节点* ^LacZ公司/+复合杂合突变体显示节点和脊索的重复，如所示嘘标记节点和脊索的表达式，或(**Q-R′**)染色节点 ^LacZ公司节点中的表达式。缺乏节重复的胚胎节点中的表达式左侧板中胚层（箭头所示）。

图8
的模型*脱中胚蛋白*原肠胚形成中的作用。(A类)在原肠胚前期，*脱中胚蛋白*和节点表达分别限于ExE和外胚层（Epi）。节点信号是首先需要诱导DVE的形成，这需要升高节段向前侧迁移的信号电平。正反馈回路ExE中的Eomes和外胚层中的Nodal之间需要保持较高的DVE迁移所需的节点信令阈值。尽管Nodal信号可以直接调节*脱中胚蛋白*在ExE中Eomes在维持节点水平方面的要求可能是间接的，可能通过ExE中前蛋白转化酶Furin和/或SPC4水平的调节。(B类)在原肠胚形成过程中，*脱中胚蛋白*表达式是起始于后部近端外胚层和PS，与之重叠节点.脱中胚蛋白参与E-cadherin下调的转录控制，对细胞横穿PS并分层为中胚层和内胚层。此外，*脱中胚蛋白*需要指定DE血统和行为与Nodal信号协同激活负责APS的靶基因规范。

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