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.2008年2月；19（2）：691-700。
doi:10.1091/mbc.e07-08-0823。 Epub 2007年12月12日。

肌醇1,4,5-三磷酸受体是自噬细胞死亡的信号分子

大卫·林 1, 阿尔特米斯·科斯塔, 玛丽·弗朗索瓦斯·卢西亚尼, 皮埃尔·戈尔斯坦
附属公司

肌醇1,4,5-三磷酸受体是自噬细胞死亡的信号分子

大卫·林等。 分子生物学细胞. 2008年2月.

摘要

控制病理生理重要自噬（ACD）和坏死（NCD）细胞死亡的信号通路尚不完全清楚。在网柄菌真核生物模型中，由于其独特的分析和遗传优势以及缺乏潜在的干扰凋亡机制，分化因子DIF导致饥饿诱导的自噬转化为ACD，或者如果atg1失活，则转化为NCD。在这里，通过随机插入突变，我们发现iplA基因（该基因是该生物体中唯一编码1，4，5-三磷酸肌醇受体（IP3R）的基因）的失活可以预防ACD。IP3R是一种配体门控通道，控制Ca（2+）从内质网储存到胞质溶胶的流出。因此，钙相关药物也影响导致ACD的DIF信号。因此，在这个系统中，ACD的主要信号通路需要IP3R和进一步的Ca（2+）依赖步骤。这是对导致自噬细胞死亡的信号通路的分子理解的首次见解之一。

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图1。
图1。
iplA和atg1的结构和突变体粘液菌菌株。（A） pUCbsrDBamHI插入在初始JH10突变克隆25A中iplA基因（登录号AJ277590）中的定位。质粒拯救和pUCbsrDBamHI每侧侧翼序列的鉴定显示其插入iplA基因7361位的DpnII位点。pUCbsrDBamHI含有一个杀囊虫素抗性标记。（B） 拯救质粒，称为iplA（ins）载体，用于通过同源重组诱变iplA基因及其插入点。使用位于pUCbsrDBamHI两侧的左右臂靶向iplA基因，通过插入导致其中断。左臂和右臂分别对应于iplA基因的位置6144-7355和7362-7610。与已发布的AX4基因组序列相比，由于菌株之间的序列差异或构建物（我们仍将其视为插入构建物）制备过程中发生的事件，在插入上游有六个核苷酸的微小缺失。该质粒用于获得简单的iplA−JH10、DH1和HMX44A中的突变体，并通过插入HMX44A.atg1-3（参见D）、双atg1−国际石油协会−HMX44A中的突变。（C） 构建物，称为iplA（del）载体，用于在iplA基因中引入缺失。PCR扩增的左臂和右臂分别对应于iplA基因的1304-2636和9713-11201位置，能够删除约7 kb的iplA基因组。该载体含有一个ura选择标记，用于在DH1中获得一个简单的iplA−和双atg1−国际石油协会−突变体。（D） 构建物，称为atg1-3载体，用于在atg1基因中引入缺失。PCR扩增的左臂和右臂分别对应于atg1基因（登录号AY191011）的位置−673至+409和712-1675，导致atg1的基因缺失约0.3 kb。使用Cre表达载体pDEX-NLS-Cre（Faix等。, 2004). 由此产生的HMX44A.atg1-3细胞对atg1基因进行了突变，并对短梗霉素敏感。在（B）中使用它们来获得双atg1−国际石油协会−突变体。
图2。
图2。
iplA公司突变细胞几乎完全抑制了DIF诱导的自噬细胞死亡。（A） DH1中的真空化被抑制。国际石油协会−（ins）受到DIF的突变细胞。野生型和DH1。国际石油协会−（ins）突变细胞饥饿8小时，然后在100 nM DIF（DIF；右）或不存在DIF（无DIF；左）的情况下清洗并进一步培养。最初8小时饥饿期后16、24或48小时的DIC显微镜照片。在DIF作用下的DH1野生型细胞中可见液泡（白色箭头）。然而，在缺乏DIF或突变株中几乎没有液泡iplA公司−受到DIF的细胞。后一组显示桨细胞（Levraud等。（黑色箭头）最常出现在细胞聚集体的外围。（B） DH1中没有出现纤维素外壳。国际石油协会−（ins）突变细胞对DIF的反应。在DIF、DH1 wt和DH1中培养16小时后。国际石油协会−（ins）突变细胞用钙氟标记。对于每种细胞类型，相控显微镜（顶部）或荧光显微镜（底部）拍摄的照片对应于相同的显微视野。箭头如A所示。只有DH1野生型，而不是DH1。国际石油协会−（ins）突变细胞空泡化，钙氟阳性。（C） DH1中克隆形成细胞死亡显著减少。国际石油协会−（ins）突变细胞比DH1野生型细胞对DIF的反应。在使用或不使用DIF培养24小时后，添加富含HL5的培养基，并在进一步48小时的培养期后对细胞进行计数。
图3。
图3。
国际石油协会突变细胞对DIF诱导的坏死细胞死亡有部分抑制作用。（A） 一些DH1。atg1-1.iplA−（del）细胞对DIF没有表现出坏死细胞死亡的形态学特征。DH1。atg1-1和DH1。atg1-1.iplA−（del）细胞饥饿16小时，然后清洗并在100 nM DIF（DIF，底部）存在或不存在的情况下进一步培养（无DIF，顶部）。添加DIF后60分钟拍摄的相差显微镜照片。白色箭头，显示坏死细胞死亡迹象的细胞；黑色箭头，单元格未显示此类标志。（B） DC-FDA阳性细胞百分比在国际石油协会−比中的iplA公司+细胞。缺少DH1。atg1-1和DH1。在1-1.iplA−（del）细胞与荧光ROS检测探针DC-FDA孵育20–30分钟，有或没有DIF，荧光DC-FDA阳性细胞通过流式细胞术定量。（C） 年ATP消耗较少国际石油协会−比中的国际石油协会+细胞。缺少DH1。atg1-1和DH1。atg1-1.iplA−将（del）细胞与DIF或不与DIF孵育20–30分钟，并使用CellTiter-Glo-Luminescent细胞活力测定试剂盒对每个细胞群中的ATP进行定量（单位为每个细胞的阿托莫）。（D） DIF诱导的质膜破裂的细胞百分比在国际石油协会−比中的国际石油协会+细胞。通过流式细胞术检测饥饿DH1细胞膜破裂，并将其量化为时间函数。atg1-1（正方形）和DH1的两个独立克隆。atg1-1.iplA−（del）（圆形；三角形）细胞培养，无（虚线）或有DIF（连续线）。相同百分比的细胞（可能是相同的细胞）显示出核周聚集、DC-FDA荧光和随后的质膜破裂。
图4。
图4。
thapsigargin或BAPTA对自噬或坏死细胞死亡的影响。（A） 在DH1中Tg可以在没有外源性DIF的情况下诱导空泡化，但在DH1中不能。国际石油协会−（ins）突变细胞。DH1和DH1。国际石油协会−（ins）突变细胞饥饿8小时，清洗，然后用Tg 5μM（底部）或不带Tg（顶部）进一步培养24小时。（B） 加利福尼亚州2+-螯合剂BAPTA抑制DIF诱导的DH1细胞空泡化。DH1和DH1。国际石油协会−（ins）突变细胞饥饿8小时，清洗，然后用DIF和BAPTA 1 mM（底部）或无BAPTA（顶部）进一步培养24小时。DH1。国际石油协会−（ins）突变细胞接受与非电针对照相同的治疗。相位对比图片。（C） Tg或BAPTA分别诱导或抑制DH1 WT细胞中的克隆原性死亡。缺少DH1和DH1。国际石油协会−将（ins）突变细胞置于DIF、Tg和BAPTA的不同组合下24小时，然后比较它们的克隆形成能力。（D） Tg可提高DIF诱导的细胞质膜破裂率。缺少DH1。atg1-1细胞在有或无DIF和Tg浓度增加的情况下孵育。2.5 h后，用流式细胞仪测定质膜破裂细胞的百分比。
图5。
图5。
环孢素A显著延缓自噬细胞死亡。（A） 环孢菌素A延迟了DIF诱导的空泡化。饥饿的DH1 wt细胞在没有（顶部）或存在（底部）1μg/ml CsA的情况下与DIF孵育。用DIF孵育16、20或24小时后的相控显微镜照片。（B） 即使在DIF后5小时添加环孢素A也会延迟液泡化。在添加DIF后1、5或15 h，向DH1 wt细胞中添加CsA（1μg/ml）。添加DIF后22小时拍摄的相控显微镜照片。（C） 环孢素A延迟DH1 wt细胞的克隆性死亡。向饥饿的DH1 wt细胞中添加或不添加CsA（1μg/ml）以及DIF。添加DIF后，在不同时间用富含HL5的培养基替换上清液。一些细胞在DIF后14小时仍然受到CsA的保护，但在以后的时间没有。
图6。
图6。
导致细胞死亡的途径示意图粘液菌单元格（请参见工具书类). 常见和自噬途径为黑色，坏死细胞死亡途径为红色。实验上，这些途径是由饥饿（没有产生足够的DIF）和添加外源DIF触发的。底部，饥饿导致自噬，准备由ACD的DIF诱导。当atg1突变时，该途径似乎会导致线粒体的改变，使其准备好被非传染性疾病的DIF诱导。顶部，DIF领先（可能通过诱导IP三生产）至IP3R活化和随后的Ca2+从内质网释放到胞浆。在g1+细胞，胞浆钙2+然后可以激活钙调素/钙调神经磷酸酶导致ACD。在atg1中−细胞，Ca2+可以促进DIF诱导的线粒体解偶联和NCD激活，而atg1的比例相当大−DIF细胞可直接改变线粒体。
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