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.2007年11月；12(5):445-56.
doi:10.1016/j.ccr.2007.08.029。

自分泌TNFalpha信号转导使人癌细胞易受Smac介导的凋亡

肖恩·彼得森 1, Lai Wang（赖王）, Asligul Yalcin琴, 林莉（Lin Li）, 迈克尔·佩顿, 约翰·米纳, 帕特里克·哈兰, 王晓东
附属公司

自分泌TNFalpha信号转导使人癌细胞易受Smac介导的凋亡

肖恩·彼得森等。 癌细胞. 2007年11月.

摘要

一种Smac/Diablo的小分子模拟物，专门对抗IAP蛋白的凋亡抑制活性，已被证明可以增强细胞表面死亡受体和化疗药物诱导的凋亡。对50个人类非小细胞肺癌细胞系的调查显示，令人惊讶的是，这些细胞系中大约有四分之一对Smac模拟物单独治疗敏感，这表明这些细胞中已经启动了凋亡信号，并被IAP蛋白控制。该信号现已被确定为自分泌细胞因子肿瘤坏死因子α（TNFalpha）。作为对自分泌TNFalpha信号的反应，Smac模拟物促进RIPK1依赖性caspase-8激活复合物的形成，从而导致细胞凋亡。

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数字

图1
图1。一组肺癌细胞株对Smac模拟物的体内外反应
（A） 测试50个非小癌细胞肺癌细胞系对单独的Smac模拟治疗的反应性。集成电路50使用cell Titer-glo（Promega）通过活细胞中的ATP水平测量细胞存活率，从而确定每个细胞系的s。集成电路50测定基于相对于未处理细胞产生半最大发光的化合物3的浓度。（B） 将所选细胞系组处理为100 nM化合物3和化合物4（如Li等人，2004所述，通过功能群配置的不同而具有类似结构的阴性对照化合物）。选择Smac趋化敏感细胞株（HCC44和HCC461）和Smac抗趋化细胞系（HCC827和H2009）。IC的每个图形表示50s和细胞存活率表示至少三个独立测试条件的平均值±SD。（C） 利用化合物3的生物素化形式的体外下拉。生物素化化合物能够在约50kDa和约70kDa的水平上拉下控制通道（仅亲和素珠）中没有的蛋白质带，这些蛋白质带是从凝胶中切下并通过质谱分析的。已识别的蛋白质已标明。（D） 小鼠HCC461细胞异种移植物对化合物3的体内反应。Harlan裸鼠皮下注射HCC461细胞，并将其随机分为治疗组（n=5），每隔一天静脉注射6次化合物3或生理盐水。实验结束前，每周对肿瘤进行两次测量。在化合物3治疗组中，2/5（40%）在实验结束时仍无肿瘤。（E） Smac抗药性HCC15细胞的小鼠异种移植对化合物3的体内反应。条件与HCC461异种移植物相同。对于肿瘤大小测量，图形表示表示每个条件下五个单独样本的平均值±SEM。
图2
图2。Smac-Mimetic-Mediated Cell Death显示Caspase激活，Caspase抑制可阻断该激活
100 nM化合物3处理一个时间过程后HCC461细胞裂解物中caspase激活的分析。对于半胱天冬酶抑制，在化合物3之前1小时添加10μM z vad fmk（Sigma）。（A） 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3激活的Western blot分析。（B） 半胱天冬酶-8激活的Western blot分析。（C） 10μM z vad拯救Smac模拟细胞死亡。（D） z-vad加化合物3处理的细胞的长期存活。按照指示对细胞进行5天的处理，以确保细胞死亡的挽救不是z vad治疗的短暂伪影。用亚甲蓝染色法测定细胞活力。每个图形表示表示至少三个独立测试条件的平均值±SD。
图3
图3。Sirna候选筛选表明TNFα信号传导是Smac-Mimetic介导细胞凋亡的必要条件
在100 nM化合物3处理后，检测细胞中特定瞬时转染的单个siRNA（Dharmacon）在HCC461细胞中产生拯救表型的能力。通过测量总ATP水平测定细胞活力。每个siRNA处理和相应的复合处理（n=4，每次转染和复合物3处理）均归一化为模拟转染对照，以说明细胞毒性。（A） Caspase-8和-9 siRNA转染。（B） TNFR1 siRNA转染。（C） TNFαsiRNA转染。D） 通过western blot测定每个siRNA的总蛋白水平敲除效率。（B）和（3）中的Caspase-8阳性对照使用了Dharmacon的siGENOME SMARTpool预先设计的四个寡核苷酸池。每个图形表示表示至少三个独立测试条件的平均值±SD。
图4
图4。自分泌TNFα信号传导是Smac模拟物介导的细胞凋亡所必需的
（A） 对Smac趋化敏感细胞系（HCC44和HCC461）和Smac抗药性细胞株（HCC827和H2009）的每个细胞系的条件细胞培养液中是否存在TNFα进行了测试。在指定的时间点取出样品，用于定量夹心酶免疫分析（R&D Systems），以确定存在的TNFα浓度，如实验程序部分所述。敏感细胞在细胞培养液中分泌低水平的TNFα，而耐药细胞系中没有检测到TNFα水平。（B） 在100 nM化合物3治疗之前，对TNFα（R&D Systems）、TRAIL（Biolegend）和FasL/CD95（Biolelend）的中和抗体（1–2 ug/mL）进行预处理（1小时）。如前所述，测定细胞活力。每个图形表示表示至少三个独立测试条件的平均值±SD。
图5
图5。Smac-Mimetic-介导的凋亡依赖于RIPK1并促进HCC461细胞中RIPK1-FADD-Caspase 8复合物的形成
（A） 靶向TNF信号通路已知成分（FADD、TRADD和RIPK1）的siRNA。通过使用靶向信使核糖核酸不同区域的单一siRNA寡聚物来验证RIPK1的依赖性。如前所述进行siRNA转染和活力测定。（B） 如前所述，siRNA转染后蛋白质水平的Western blot分析。（C） RIPK1、FADD、caspase-8复合物联合免疫沉淀，使用caspase-9抗体（Santa Cruz，SC-6136）。按照规定的方式处理细胞，并按照实验程序进行联合免疫沉淀。添加Z vad作为捕获与RIPK1和FADD复合物中caspase-8的手段，阻止复合物从caspase-8.中完全激活和随后的解离。每个图形表示表示至少三个独立测试条件的平均值±SD。
图6
图6。其他Smac-Mimetic-Sensitive细胞的反应方式与HCC461细胞相似
通过siRNA转染和中和抗体预处理对HCC44、MDA-MB-231和SK MEL-5细胞系进行拯救试验。靶向caspase-8、TNFR1、TNFα和RIPK1（Dharmacon siGENOME SMARTpool预先设计的四个寡核苷酸池）的siRNA，以及针对TNFα的中和抗体（R&D系统），能够将这些细胞株从Smac-mimetic介导的凋亡中解救出来，而caspase-9 siRNA转染（Dharmcon siGENOME SMARTpool）而用TRAIL（Biolegend）中和抗体预处理则无拯救作用。（A） HCC44。（B） MDA-MB-231。（C） SK MEL-5。（D） H2009细胞对100 nM化合物3和100 ng/ml TNFα有反应。caspase-8、TNFR1和RIPK1的siRNA敲除能够从化合物3/TNFα共处理中拯救这些细胞。如前所述，进行siRNA转染和细胞活性测定。每个图形表示表示至少三个独立测试条件的平均值±SD。
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