Calcineurin promotes hypoxia-inducible factor 1alpha expression by dephosphorylating RACK1 and blocking RACK1 dimerization

doi:10.1074/jbc.M705015200

.2007年12月21日；282(51):37064-73.

doi:10.1074/jbc。M705015200。 Epub 2007年10月26日。

钙调神经磷酸酶通过去磷酸化RACK1和阻断RACK1二聚体促进低氧诱导因子1alpha的表达

叶五柳¹, Maimon E Hubbi酒店, 风扇盘, 卡琳·麦克唐纳, 马利尼·曼沙拉马尼, 罗伯特·N·科尔, Jun O Liu（刘军）, 格雷格·塞门扎

附属公司

PMID： 17965024
预防性维修识别码：项目经理3754800
内政部： 10.1074/jbc。M705015200型

钙调神经磷酸酶通过去磷酸化RACK1和阻断RACK1二聚化来促进缺氧诱导因子1α的表达

叶五柳等。生物化学杂志. 2007.

.2007年12月21日；282(51):37064-73.

doi:10.1074/jbc。M705015200。 Epub 2007年10月26日。

作者

叶五柳¹, Maimon E Hubbi酒店, 风扇盘, 卡琳·R·麦克唐纳, 马利尼·曼沙拉马尼, 罗伯特·N·科尔, Jun O Liu（刘军）, 格雷格·塞门扎

附属

¹美国马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院质谱蛋白质组设施药理学和分子科学系细胞工程研究所血管项目，邮编21205。

PMID： 17965024
预防性维修识别码：项目经理3754800
内政部： 10.1074/jbc。M705015200型

摘要

氧稳态是后生动物进化和生物学的基本组织原则。低氧诱导因子1（HIF-1）是对O2浓度变化的转录反应的主要调节器。HIF-1是HIF-1α和HIF-1β亚单位的异二聚体。HIF-1α亚单位的O2-依赖性降解由脯氨酰羟化酶、von Hippel-Lindau蛋白（VHL）/Elongin-C E3泛素连接酶和蛋白酶体介导。HIF-1α的O2-非依赖性降解受RACK1和HSP90与HIF-1 alpha结合的竞争调节。RACK1结合导致伸长素-C E3泛素连接酶的招募，导致VHL非依赖性泛素化和HIF-1α降解。在本报告中，我们显示钙调神经磷酸酶抑制HIF-1α的泛素化和蛋白酶体降解。钙调神经磷酸酶是一种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，由钙和钙调蛋白激活。钙调磷酸酶活性是调节HIF-1α所必需的。RACK1与钙调神经磷酸酶的催化结构域结合，是钙调神经蛋白抑制剂环孢霉素A诱导的HIF-1α降解所必需的。伸长素-C和HIF-1 alpha都与RACK1结合，RACK1的二聚化需要将伸长素C招募到HIF-1 Alpha。RACK1的磷酸化促进其二聚化，钙调神经磷酸酶的去磷酸化抑制二聚化。二聚化结构域内的丝氨酸146被磷酸化，丝氨酸146的突变损害RACK1二聚化和HIF-1α降解。这些结果表明，细胞内钙水平可以通过调节钙调神经磷酸酶活性和RACK1二聚体来调节HIF-1α的表达。

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数字

**图1。钙调磷酸酶A增加HIF-1α缺氧和非缺氧条件下的蛋白质水平**
A类，CnA增加HIF-1α共转染细胞中的蛋白质水平。HEK293T细胞与EV或编码FLAG-HIF-1的表达载体共转染α或HA-CnA。细胞暴露于20或1%的O₂对WCL进行IB试验，检测FLAG-HIF-1α、HA-CnA和β-肌动蛋白。B类，钙调神经磷酸酶A增加共转染HIF-1介导的转录αHEK293T细胞与pSV-Renilla共转染，其中*雷尼利亚*荧光素酶由SV40启动子表达；p2.1，包含SV40启动子上游的缺氧反应元件和萤火虫荧光素酶编码序列；和EV或矢量编码FLAG-HIF-1α或HA-CnA。细胞暴露于20或1%的O₂24小时后，细胞被裂解，萤火虫的比例：*雷尼利亚*测定荧光素酶活性。将结果归一化为转染EV并在20%O培养的细胞的结果₂（显示平均值±S.D.）。*，第页<0.05，用于指示比较。C类，钙调神经磷酸酶A增加内源性HIF-1α蛋白质水平。用EV或编码HA-CnA的载体转染HEK293T细胞。细胞暴露于20或1%的O₂对WCL进行IB试验，检测HIF-1α、HA-CnA和β-肌动蛋白。D类，钙调神经磷酸酶A增加内源性HIF-1介导的转录αHEK293T细胞与pSV共转染-*雷尼利亚*第2.1页和EV或HA-CnA。细胞暴露于20或1%的O₂24小时后，细胞被裂解，萤火虫的比例：*雷尼利亚*测定荧光素酶活性。将结果归一化为转染EV并在20%O培养的细胞的结果₂（显示平均值±S.D.）。*，第页<0.05，用于指示比较。插入，20%O时的荧光素酶活性₂.

**图2。钙调神经磷酸酶对HIF-1和NFAT依赖性转录具有类似的作用**
A类钙调神经磷酸酶表达载体对HIF-1和NFAT依赖性转录的影响。HEK293T细胞与对照报告质粒pSV共转染-*雷尼利亚*和HIF-1依赖性报告质粒p2.1(*左侧面板*)或NFAT依赖性报告质粒pNFAT-Luc(*右侧面板*). 用FLAG-HIF-1联合转染细胞α载体+附加表达载体+2.5的处理μM环孢素A，如图所示。B类，HA标记的钙调神经磷酸酶亚基表达对FLAG-HIF-1水平的影响α和β-肌动蛋白蛋白。细胞被转染为*面板A*除了没有报告质粒。使用转染24小时后制备的WCL等分样品进行IB分析。

**图3。钙调磷酸酶活性调节HIF-1α**
A类，离子霉素增加HIF-1α蛋白质水平。用FLAG-HIF-1转染HEK293T细胞α表达式向量。用指定浓度的载体或离子霉素处理细胞6小时。WCL进行IB分析以检测FLAG-HIF-1α、CnA和β-肌动蛋白。B类，环孢素A降低HIF-1α蛋白质表达。用FLAG-HIF-1联合转染HEK293T细胞αEV或HA-CnA表达载体。用2.5μM环孢霉素A作用6 h后，WCL进行IB试验以检测FLAG-HIF-1α、HA-CnA和β-肌动蛋白。

**图4。钙调神经磷酸酶A调节HIF-1α以PHD/VHL独立、泛素/蛋白酶体依赖的方式**
A类钙调神经磷酸酶A增加HIF-1野生型和羟基化抗性突变型的水平α以蛋白酶体依赖的方式抑制其降解。HEK293T细胞与EV、野生型FLAG-HIF-1共转染α，标志HIF-1α-（P420A/P564A）或HA CnA。细胞用载体或10μM MG132持续4 h。WCL接受IB分析以检测FLAG-HIF-1α、HA-CnA和β-肌动蛋白。B类钙调神经磷酸酶A增加HIF-1野生型和羟基化抗性突变形式介导的转录αHEK293T细胞与pSV-Renilla，p2.1，野生型FLAG-HIF-1共转染α或FLAG-HIF-1α（P420A/P564A）和EV或HA-CnA。细胞被裂解，萤火虫的比率：*雷尼利亚*测定荧光素酶活性。将结果归一化为转染EV并在20%O培养的细胞的结果₂（显示平均值±S.D.）。*，第页<0.05，用于指示比较。C类，钙调神经磷酸酶增加HIF-1α以VHL无关的方式表达蛋白质。VHL缺陷的RCC4细胞用载体或指示浓度的离子霉素或环孢素A处理16小时。WCL进行IB分析以检测HIF-1α、CnA和β-肌动蛋白。D类钙调神经磷酸酶A降低HIF-1的泛素化α.含有FLAG-HIF-1的WCL等份α-（P402A/P564A）与含有或不含HA-CnA的His标记泛素的WCL孵育。用抗FLAG抗体进行WCL的IP。使用抗-His和抗FLAG抗体检测泛素化和总FLAG-HIF-1α在FLAG IP之后。

**图5。RACK1与钙调神经磷酸酶A结合，是环孢素A诱导的HIF-1所必需的α退化，退化**
A类，RACK1结合全长钙调神经磷酸酶A和钙调神经蛋白A的分离催化域*在体外*纯化GST或GST-RACK1与*在体外*转录、翻译和³⁵钙调神经磷酸酶A的S标记全长或氨基末端401氨基酸(*IVTT-CnA公司*(*佛罗里达州*)或*IVTT-CnA公司*(*1– 401*)）；捕获于谷胱甘肽（GSH）-Sepharose珠；SDS-PAGE和放射自显影分析(顶部和*中间面板*)和带有抗GST的IB分析(*底部面板*). 还将等分的IVTT产品直接涂抹在凝胶上(输入).B类，内源性RACK1和转染的HA-CnA的共-IP。WCL由转染EV或HA-CnA的HEK293T细胞制备。使用抗HA抗体进行IP。对WCL和IP产品进行IB分析，以检测HA-CnA、RACK1和β-肌动蛋白。C类，RACK1 WD4结构域与钙调神经磷酸酶A的全长和氨基末端催化结构域结合*在体外*纯化的GST或GST-RACK1-WD4与IVTT-CnA（FL）或IVTT-CnCnA（1-401）孵育，捕获于GSH-Sepharose珠上，并通过SDS-PAGE进行分析，然后进行放射自显影(顶部和*中间面板*)和带有抗GST的IB分析(*底部面板*). 还将等分的IVTT产品直接涂抹在凝胶上(输入).D类，RACK1模块HIF-1α环孢素A诱导的降解。HEK293T细胞与FLAG-HIF-1共转染α和针对RACK1 mRNA的短发夹RNA(*shRNA-应答1*)或加扰的阴性对照(*shRNA-SNC*). 用载体或2.5处理细胞μM环孢霉素A作用6小时后，WCL接受IB分析以检测FLAG-HIF-1α、CnA、，β-肌动蛋白和RACK1。HIF-1标记α通过密度分析量化水平(*波段强度*).

**图6。钙调神经磷酸酶A阻断RACK1的二聚化和HIF-1的去磷酸化α退化，退化**
A类，RACK1羧基末端结构域不足以降解HIF-1αHEK293T细胞与EV、FLAG-HIF-1共转染α、全长T7-RACK1-WD1–7或羧基终端T7-RACK1-WD5–7。WCL接受IB分析以检测FLAG-HIF-1α,β-肌动蛋白和RACK1。B类全长GST-RACK1-WD1-7，而不是GST-RACK1-WD56，只有在37°C培养时才能通过二聚化作用降低内源性RACK1。GST-RACK1-WD1-7或GST-RACK1-WD56与来自HEK293T细胞的WCL在4或37°C下孵育30分钟。GST融合蛋白被捕获在GSH-Sepharose珠上，并通过SDS-PAGE分析，然后通过IB分析检测GST-RACX1和抗GST抗体(*顶部面板*)内源性RACK1和抗RACK1抗体(*底部面板*).C类，GST-RACK1的pI在37°C、ATP存在下与WCL孵育后降低。GST-RACK1与来自HEK293T细胞的WCL在4或37°C下与1 mM ATP孵育。在GSH-Sepharose微球上捕获GST-RACK1，并通过二维PAGE和考马斯蓝染色进行分析。D类，通过ATP和钙调节RACK1二聚体。GST-RACK1与来自HEK293T细胞的WCL在37°C下与1 mM ATP或10 mM ATP孵育μM离子霉素。GST-RACK1被捕获在GSH-Sepharose珠上。使用抗GST或抗RACK1抗体通过IB分析来分析下拉产物或WCL。E类钙调神经磷酸酶A和钙降低RACK1磷酸化并抑制RACK1二聚化。GST-RACK1与从转染EV或HA-CnA表达载体的HEK293T细胞制备的WCL在37°C下孵育，添加或不添加1mM CaCl₂GST-RACK1被捕获在GSH-Sepharose珠上。通过IB分析对下拉产物进行分析，以检测GST-RACK1和抗GST(*顶部面板*)或带有防RACK1的RACK1(*第二个面板*从底部)抗体和SDS-PAGE结合ProQ-Diamond磷酸蛋白染色(*底部面板*). WCL接受IB分析以检测HA-CnA(*第二面板*从顶部)和机架1(*中间面板*).F类，HEK293T细胞与FLAG-HIF-1共转染α用载体或1μM离子霉素在10的存在下μ收集WCL前，M MG132持续6小时。用抗FLAG抗体进行IP。对WCL和IP产品进行IB分析以检测FLAG-HIF-1α、CnA、，β-肌动蛋白和Myc-Elongin-C。

**图7。丝氨酸146是磷酸化的靶点，是高效RACK1二聚化和HIF-1所必需的α退化，退化**
A类，根据NetPhos分配的分数识别RACK1的WD4域中的候选磷酸化位点。B类，丝氨酸146对RACK1介导的HIF-1至关重要α退化。HEK293T细胞与编码FLAG-HIF-1的载体共转染α和野生型或T7-RACK1的指定突变形式。WCL接受IB分析以检测FLAG-HIF-1α、机架1和β-肌动蛋白。C类，丝氨酸146突变对RACK1二聚化的影响。野生型(重量)或S146G突变体形式的GST-RACK1与WCL在4或37°C下孵育。GST融合蛋白被捕获在GSH-Sepharose珠上。使用抗GST的IB分析对下拉产品进行分析(*中间面板*)或防RACK1(*底部面板*)抗体。WCL中的内源性RACK1也通过IB分析进行分析(*顶部面板*).D类丝氨酸146突变对RACK1磷酸化的影响。将GST-RACK1的WT或S146G突变形式与WCL在4或37°C下在0.3 mCi的存在下孵育[γ-³²P] ATP。GST融合蛋白被捕获在GSH-Sepharose珠上。将下拉产物进行SDS-PAGE，然后进行考马斯蓝染色和放射自显影。

**图8。钙调磷酸酶使RACK1去磷酸化，抑制RACK1二聚化，并阻断RACK1介导的泛素化和HIF-1降解α**
WD4结构域的磷酸化促进RACK1二聚化。每个单体的WD6结构域与HIF-1结合α或Elongin-C.HIF-1α被E3泛素连接酶复合物泛素化（由Elongin-B组成(B类)，卡林-2(*文化2*)，环盒蛋白1(*RBX1型*)和E2泛素结合酶(*E2级*)与Elongin-C泛素化相关(乌比)HIF-1的α以蛋白质为目标，由26S蛋白酶体降解。钙依赖性磷酸酶钙调神经磷酸酶使RACK1去磷酸化，抑制RACK1二聚体化，从而减少HIF-1的关联α具有伸长素-C E3泛素连接酶复合物。因此，HIF-1α防止泛素化和蛋白酶体降解。环孢菌素A抑制钙调神经磷酸酶活性，从而增加RACK1二聚化和HIF-1α降解。

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