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.2007年10月；48(10):4407-20.
doi:10.1167/iovs.07-0432。

早期AMD的SOD2击倒小鼠模型

垂直对齐 1, Ji-Jing Pang公司, Kutralanathan Renganathan公司, 仙泉占, 约翰·W·克拉布, 所以Ra Kim, 珍妮特·斯派洛, 威廉·豪斯沃思, 阿尔弗雷德·S·勒温
附属公司

早期AMD的SOD2击倒小鼠模型

Verline Justilien公司等人。 投资眼科视觉科学. 2007年10月.

摘要

目的：验证视网膜色素上皮（RPE）氧化损伤可能导致与年龄相关性黄斑变性（AMD）早期相关的视网膜损伤的假设。

方法：在RPE-J细胞中表达一种靶向保护酶锰超氧化物歧化酶（MnSOD）的核酶，并在成年C57BL/6小鼠视网膜下注射表达核酶基因的腺相关病毒（AAV）。使用免疫印迹分析和LC-MS/MS鉴定蛋白质和硝化位点，检测RPE/脉络膜复合物的SOD2蛋白水平和氧化损伤的蛋白质标记。从视网膜组织中提取脂质，并分析双维A酸化合物A2E和iso-A2E。通过全视野视网膜电图（ERG）分析小鼠的光反应。光镜和电子显微镜用于测量视网膜的细胞学变化。

结果：Rz432处理RPE-J细胞导致MnSOD mRNA和蛋白降低，超氧阴离子水平升高，细胞凋亡。当由AAV递送时，Rz432降低了MnSOD蛋白并增加了氧化损伤标记物，包括小鼠RPE-脉络膜中的硝化和羧乙基吡咯修饰蛋白。核糖核酸酶的递送导致视网膜电图反应的逐渐丧失、空泡化、视网膜色素上皮变性、布鲁赫膜增厚以及光感受器外段和内段的缩短和紊乱。凋亡细胞死亡导致感光细胞外核层逐渐变薄。与AMD患者的眼睛类似，经核酶治疗的眼睛显示出增强的自体荧光和升高的A2E和iso-A2E水平，这是脂褐素的主要双维A色素。

结论：这些结果支持了这样的假设，即RPE的氧化损伤可能在AMD的一些关键特征中起作用。

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数字

图1。
图1。
靶向MnSOD和AAV的锤头状核酶的二级结构包装构造。(A类)MnSOD Rz432及其mRNA的序列分析具有裂解位点的靶向序列(粗箭头). 核苷酸改变位置以产生非活性MnSOD Rz432(细箭头).(B类)用于生产的重组AAV盒CBA-SOD2Rz432/CMV-GFP病毒载体。TR，倒置终端重复；CMV、，巨细胞病毒；CBA、鸡肉β-肌动蛋白；SD/SA，拼接供体/受体位点；人源化绿色荧光蛋白。
图2。
图2。
Rz432对RPE-J细胞MnSOD表达的影响。(A类)一式三份测定MnSOD转录水平的定量转录PCR。β-肌动蛋白在相同条件下扩增反应被用作内部控制。PCR产物由SYBR定量绿色染色。24小时后，MnSOD转录物显著减少Rz432治疗后数小时(P（P）< 0.05).(B类)Rz432或GFP处理的细胞。4天后MnSOD mRNA和蛋白水平恢复正常天，因为瞬时转染。进行了这个实验两次，结果基本相同。
图3。
图3。
RPE中Rz432的表达降低了视网膜中的MnSOD蛋白。(A类)6周后Rz432-GFP表达的定位注入(绿色).左侧：全安装从前表面观察视网膜。插入：更高放大显示六角RPE细胞的GFP转导。赖特：视网膜的横切面用DAPI复染以显示细胞核(蓝色). 一张单人床矢量的注入几乎转换了RPE的整个范围。插入：高倍放大显示转导RPE而非感光细胞。(B类)Rz432表达式降低RPE/脉络膜中的MnSOD蛋白水平。各组小鼠的分析方法为注射6周后MnSOD水平的Western blot检测(左边).β-肌动蛋白被用作加载物控件。图表显示了MnSOD与β-肌动蛋白信号(n个= 6). 锰超氧化物歧化酶蛋白的代表性免疫印迹Rz432的RPE/脉络膜和非活性Rz治疗眼(正确的).
图4。
图4。
MnSOD2的抑制导致氧化标记物的积累强调。硝基酪氨酸的蛋白质印迹分析(A类)和羧乙基吡咯(B类)用蛋白质提取物后眼杯。Rz432治疗的眼睛显示硝基酪氨酸和羧乙基吡咯的免疫反应条带（免疫印迹）。硝基酪氨酸和羧乙基吡咯带通过扫描和测量光密度（散射图）。（◇）Rz432处理；(□)控件。(P（P）<0.03，对于硝基酪氨酸和P（P）羧乙基吡咯<0.045；n个= 6).
图5。
图5。
用Rz432治疗野生型小鼠导致光反应降低。(A类)在1、2、4和6时测量Scotopic全视野ERG成年野生型C57BL/6小鼠注射AAV-Rz432或AAV-GFP控制矢量。1的典型ERG波形-显示了6个月的时间点。R（右眼），AAV-Rz432；L（左眼），AAV-GFP控制载体。(B类)用Rz432治疗的小鼠显示4个月后ERG反应逐渐消失注入。该图表示最大a波和b波的比率Rz432至GFP控制的振幅*P（P）< 0.05;**P（P）< 0.005. 误差线，SEM。
图6。
图6。
Rz432对小鼠的外视网膜造成组织学损伤。(A类)C57BL/6小鼠第1、2和4天视网膜的显微照片Rz432治疗后个月或GFP对照治疗后4个月矢量。Rz432处理的视网膜出现色素改变(箭头)RPE变性(箭头)以及逐渐变薄感光核层。视网膜色素上皮；操作系统，光感受器外节；IS，光感受器内节；ONL，外部核层；INL，内核层；IPL，内丛状层。比例尺，50μ米(B类)厚度的量化ONL的。视神经头是一个里程碑，测量结果如下200时拍摄-μ两处视神经的m增量视网膜的上下部分(n个=3用于每个时间点）。误差线，SEM*P（P）<0.05–P（P）< 0.01. (C类)渐进式感光细胞的丢失是由于凋亡细胞死亡所致。TUNEL染色为用于检测Rz432治疗6周后视网膜中的凋亡细胞核(左边).绿色：Rz432-GFP表达；红色：TUNEL阳性细胞核；蓝色、DAPI染色的细胞核。(D类)凋亡细胞死亡的量化注射后6周核小体释放试验(正确的).*P（P）< 0.003 (n个=6）。
图6。
图6。
Rz432对小鼠外视网膜造成组织学损伤。(A类)C57BL/6小鼠第1、2和4天视网膜的显微照片Rz432治疗后个月或GFP对照治疗后4个月矢量。Rz432处理的视网膜出现色素改变(箭头)和RPE变性(箭头)以及逐渐变薄感光核层。视网膜色素上皮；操作系统，光感受器外节；IS，光感受器内节；ONL，外部核层；INL，内核层；IPL，内丛状层。比例尺，50μ米(B类)厚度的量化ONL的。视神经头是一个里程碑，测量结果如下200时拍摄-μ两处视神经的m增量视网膜的上下部分(n个=3用于每个时间点）。误差线，SEM*P（P）<0.05–P（P）< 0.01. (C类)渐进式感光细胞的丢失是由于凋亡细胞死亡所致。TUNEL染色为用于检测Rz432治疗6周后视网膜中的凋亡细胞核(左边).绿色：Rz432-GFP表达；红色：TUNEL阳性细胞核；蓝色、DAPI染色的细胞核。(D类)凋亡细胞死亡的量化注射后6周核小体释放试验(正确的).*P（P）< 0.003 (n个= 6).
图6。
图6。
Rz432对小鼠外视网膜造成组织学损伤。(A类)C57BL/6小鼠在1、2和4时视网膜的光显微照片Rz432治疗后个月或GFP对照治疗后4个月矢量。Rz432处理的视网膜出现色素改变(箭头)和RPE变性(箭头)以及逐渐变薄感光核层。视网膜色素上皮；操作系统，光感受器外节；IS，光感受器内节；ONL，外部核层；INL，内核层；IPL，内丛状层。比例尺，50μ米(B类)厚度的量化ONL的。视神经头是一个里程碑，测量结果如下200时拍摄-μ两处视神经的m增量视网膜的上下部分(n个=3用于每个时间点）。误差线，SEM*P（P）<0.05–P（P）< 0.01. (C类)渐进式感光细胞的丢失是由于凋亡细胞死亡所致。TUNEL染色为用于检测Rz432治疗后6周视网膜中的凋亡细胞核(左边).绿色：Rz432-GFP表达；红色：TUNEL阳性细胞核；蓝色、DAPI染色的细胞核。(D类)凋亡细胞死亡的量化注射后6周核小体释放试验(正确的).*P（P）< 0.003 (n个= 6).
图7。
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AAV-Rz432后4个月外视网膜超微结构变化治疗。(A类)活性Rz432治疗的视网膜(A2类,A4（A4）)与对照非活性Rz432注射视网膜相比(A1类,A3号)RPE出现扩张空泡化增加，细胞核形状不规则。外部和内部光感受器节段缩短，排列紊乱。(B类)Rz432处理视网膜的电子显微照片显示在RPE的质膜和基膜以及紊乱和布鲁赫膜层增厚。BlamD，基础层流沉积。比例尺(A1、A2) 10μ米；(A3号,A4（A4）) 5μ米；(B类) 0.5μ米。
图7。
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AAV-Rz432后4个月外视网膜超微结构变化治疗。(A类)活性Rz432处理的视网膜(A2类,A4（A4）)与对照非活性Rz432注射视网膜相比(A1类,A3号)，RPE出现扩张空泡化增加，细胞核形状不规则。外部和内部光感受器节段缩短，排列紊乱。(B类)Rz432处理视网膜的电子显微照片显示在RPE的质膜和基膜以及紊乱和布鲁赫膜层增厚。BlamD，基础层流沉积。比例尺(A1、A2) 10μ米；(A3号,A4（A4）)5个μ米；(B类) 0.5μ米。
图8。
图8。
氧化应激视网膜的自体荧光增强。(A类)注射后4.5个月RPE/脉络膜/巩膜由多聚甲醛和通过荧光显微镜检查（激发，405 nm；发射，590–650 nm）检测GFP存在时的自体荧光AAV载体的荧光。(B类)A2E/iso-A2E的定量在核酶介导的SOD2击倒后，在小鼠眼睛中。小鼠后眼在4.5个月大的时候对杯子进行DBAJ/1分析，其中含有Leu450RPE65的变体，C57BL/6J为5到6个月，其中包含Met450RPE65的变体。色素通过HPLC检测，监测波长为430 nm。高级工程师分别测量和汇总iso-A2E水平。结果基于单个样品（4.5个月）或两个样品（5-6）的平均值（±SEM个月）。每个样本包含三到四只眼睛。
图8。
图8。
氧化应激视网膜的自体荧光增强。(A类)注射后4.5个月RPE/脉络膜/巩膜由多聚甲醛和通过荧光显微镜检查（激发，405 nm；发射，590–650 nm）检测GFP存在时的自体荧光AAV载体的荧光。(B类)A2E/iso-A2E的定量在核酶介导的SOD2敲除后的小鼠眼睛中。小鼠后眼在4.5个月大的时候对杯子进行DBAJ/1分析，其中含有Leu450RPE65的变体，C57BL/6J为5到6个月，其中包含Met450RPE65的变体。色素通过HPLC检测，监测波长为430 nm。高级工程师分别测量和汇总iso-A2E水平。结果基于单个样品（4.5个月）或两个样品（5-6）的平均值（±SEM个月）。每个样本包含三到四只眼睛。
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