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.2007年9月26日；27(39):10445-55.
doi:10.1523/JNEUROSCI.2883-07.2007。

持续的Arc/Arg3.1合成通过调节体内齿状回中的局部肌动蛋白聚合来控制长期增强巩固

Elhoucine Messaoudi公司 1, Tambudzai Kanhema公司, 乔纳森·索莱, 阿德里安·蒂龙, Girstaute Dagyte公司, 布鲁诺·达席尔瓦, 克莱夫·R·布拉姆汉姆
附属公司

持续的Arc/Arg3.1合成通过调节体内齿状回中的局部肌动蛋白聚合来控制长期增强巩固

Elhoucine Messaoudi公司等。 神经科学. .

摘要

新的基因表达对于长期增强（LTP）巩固是必要的，但特定活性诱导的mRNA的作用尚未确定。在这里，我们在活体齿状回LTP过程中，通过在多个时间点局部注射反义（AS）寡核苷酸，探讨了活性诱导的Arc（活性调节细胞骨架相关蛋白）/Arg3.1（活性调节基因3.1蛋白同源物）mRNA的动态功能。令人惊讶的是，早期的Arc合成对于LTP的早期表达是必要的，而持续的合成则需要产生稳定的修饰突触。在LTP诱导后2小时施用AS导致LTP的快速和永久逆转。这种逆转与上调的Arc的快速击倒、肌动蛋白解聚因子/cofilin的去磷酸化以及突触部位新生丝状肌动蛋白（F-actin）的丢失有关。在LTP维持期间输注F-肌动蛋白稳定药物茉莉糖苷阻断AS逆转LTP的能力。这些结果将活性诱导的Arc表达与持久LTP下的肌动蛋白细胞骨架的扩张相结合。此外，Arc合成对于局部BDNF输注诱导的LTP的诱导和巩固都是必需的，从而确定Arc是BDNF在突触可塑性中的关键分子效应器。

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数字

图1。
图1。
LTP诱导后齿状回Arc mRNA和蛋白表达变化的时间进程。弧就地在高频刺激内侧穿通通路后的五个时间点进行杂交（ISH）和免疫组织化学（IHC）。高频刺激包括三次400 Hz脉冲，每次间隔5分钟（总持续时间为10分钟）。对照组未接受电极植入（CON）或仅接受电极植入和低频测试刺激（LFS）。A类，每个时间点的代表性图像（HFS后分钟）。n个=每个时间点4-5。B类，齿状分子层染色定量分析。测量齿状回内叶分子层的光密度。将同侧LTP侧的光密度变化归一化为对侧对照值。数值为平均值±SEM。
图2。
图2。
高频刺激后2小时电弧反义输注阻断LTP巩固。时间进程图显示了以基线百分比表示的内侧执行路径诱发fEPSP斜率的变化。数值为平均值±SEM。箭头表示HFS。Arc AS-和SC-ODN的输液分别以填充和开放条表示。A类，Top，局部输注（1μl，0.5 m米，12.5分钟）。基线记录结束时（基线）、AS输注前（后-HFS）和记录结束时收集的底部平均场电位记录道（4次扫描）。校准：5 mV，2 ms。B类HFS后4h输注Arc AS-ODN对LTP维持无影响。CHFS后2 h输注SC Arc ODN对LTP维持无影响。D类Arc AS输注对基础突触疗效无影响。E类靶向Arc mRNA非重叠区域的第二个AS序列（AS2）的输注同样逆转了正在进行的LTP(n个= 5).F类fEPSP斜率变化幅度。n个在所有组中=5-8*第页<0.05，与基线显著不同。G公司，LTP逆转与Arc蛋白的特异性敲除相耦合。齿状回匀浆中蛋白质印迹的定量。实验结束时收集了组织，如A类和C在AS处理的大鼠中，Arc的表达显著降低，但β-肌动蛋白、α-CaMKII或PSD-95的表达不显著(*第页< 0.05). 代表性免疫印迹：+表示注入齿状回，−表示对侧非融合齿状回。
图3。
图3。
反义电弧瞬时抑制早期LTP表达。A类,B类，注入Arc AS 90 min时，fEPSP的LTP未降低(A类)或15分钟(B类)HFS之前。C,D类HFS前5分钟输注Arc AS(C)或HFS后15分钟(D类)导致LTP瞬态抑制。D类底部，LTP图中所示时间点采集的平均场电位记录道（4次扫描）。E类，在SC治疗的对照组中观察到非降低的LTP。F类条形图显示HFS前5分钟输注Arc AS大鼠的fEPSP和Arc蛋白表达的变化。HFS后1 h（逆转）两组数值均无变化，3 h（恢复）显著升高(第页< 0.05). fEPSP以基线百分比表示。Western blots上的Arc蛋白免疫反应以对侧对照的百分比表示。n个在所有组中=6-8。代表性的蛋白质斑点如右图所示。
图4。
图4。
LTP逆转与快速下调上调的Arc mRNA和蛋白表达有关。LTP诱导后2h灌注Arc AS或SC-ODN，1h后经心灌注固定大脑。A类，为就地使用地高辛标记的Arc核糖探针进行杂交显示，SC处理对照组颗粒细胞体和树突中的Arc mRNA显著上调。弧Arc AS治疗后mRNA表达受到强烈抑制。右下角的面板显示了经AS处理和经SC处理的齿状回的高倍图像。CON，对侧非处理齿状回。这些是基于每个治疗组的五个实验的代表性图像。图像取自记录位置～300μm范围内的中背齿状回。B类, α-CaMKII公司Arc AS处理和对侧齿状回的mRNA表达。C，电弧免疫组化染色。与时间匹配的SC治疗对照组相比，AS治疗组大鼠齿状分子和颗粒细胞层中的Arc表达降低。右下面板显示了HFS后2小时AS或SC输注后60分钟和30分钟电弧染色的高清晰度图像。条形图显示了1小时时齿状分子层免疫组织化学染色的定量分析。沿着延伸穿过齿状回内叶分子层的线获得光密度测量，并将其标准化为CA1放射层的背景染色。AS治疗后Arc蛋白表达的变化归一化为SC治疗对照*第页< 0.05.
图5。
图5。
在LTP期间，需要晚期电弧合成来稳定F-actin。HFS后2h局部灌注Arc AS或SC-ODN，1h后经心灌注固定大脑。冠状切片用阴茎肽-FITC染色。A类左上角，在SC处理的大鼠齿状回中观察到一条特定于内侧穿支通路终止区的指骨样蛋白染色带。右上，对侧，未刺激齿状回（CON）。左下角，Arc AS治疗消除了增强型阴茎肽染色带。右下，SC和AS治疗大鼠的阴茎肽染色比较。OML，外分子层；MML，中间分子层；IML，内分子层；GCL，颗粒细胞层。箭头标记中间分子层中的卵磷脂染色。白色条表示海马裂。基于四只AS治疗大鼠和五只SC治疗大鼠的代表性图像。补充图1显示了指骨肽标记的时间过程（可在网址：www.jneurosci.org作为补充材料）。B类，接受SC（灰色）或AS（黑色）输注的大鼠的指骨样肽–FITC荧光强度比（同侧/对侧）的剖面。沿最短直线（矩形A类)从颗粒细胞层边界上方20μm延伸至海马裂。取10个相邻像素的光密度值的平均值。相对于CA1中的参考区域（中的小方框A类). 取齿状回内叶三个部位的平均值，并求出各组平均值。所有切片均来自记录位置300μm范围内。C在400 Hz的频率下2小时后进行磷脂酶染色，每隔10秒施加八次脉冲。齿状回的中间分子层出现一条明亮、界限分明的带。D类输注F-肌动蛋白稳定剂茉莉糖苷阻断Arc AS对LTP维持的抑制作用。茉莉花素内酯（Jasp；1μ米)在HFS后指定的时间注入Arc AS。jasplakinolide预处理不会影响持续的LTP，并消除了Arc AS对LTP维持的影响。茉莉花碱内酯或Arc输注前和输注后10分钟获得的六个连续反应的fEPSP斜率测量值没有显著差异(第页< 0.05).
图6。
图6。
在LTP过程中，电弧合成是维持辅菲林过度磷酸化所必需的。A类在HFS后2 h和LTP期间输注AS或SC Arc ODN后2 h制备的齿状回匀浆中进行Western blot。Cofilin磷酸化在LTP期间显著增强，Arc AS治疗抑制了这种增强(*第页< 0.05;n个=所有组中的6–7）。总cofilin和其他肌动蛋白相关蛋白的表达没有变化。B类，代表性免疫印迹。+表示ODN注入齿状回；−表示对侧非融合齿状回。
图7。
图7。
Arc AS阻止了BDNF诱导的LTP的诱导和巩固。时间进程图显示了以基线百分比表示的内侧穿通径诱发fEPSP斜率的变化（平均值±SEM）。在BDNF前90分钟输注Arc AS寡核苷酸或SC Arc序列。A类，在SC治疗的大鼠中诱导了健壮的BDNF–LTP(n个= 5;第页< 0.05).B类，Arc AS预处理废除了BDNF–LTP(n个= 6;第页> 0.05). BDNF输注前和输注后2 h测得的fEPSP斜率值无显著差异(第页> 0.05).C、Top、Arc AS 2小时输注快速逆转持续的BDNF–LTP(n个= 5;第页< 0.05). 在指定时间（1）采集的底部平均场电位记录道（4次扫描）。基线；2、BDNF后；3，在AS之后）。校准：2 mV，2 ms。D类，2小时输注SC Arc ODN对持续的BDNF–LTP没有显著影响(n个= 5;第页> 0.05).E类，4小时Arc AS输注对BDNF–LTP维持没有显著影响(n个= 6;第页> 0.05).F类fEPSP斜率和种群峰值变化的幅度。n个在所有组中=5-7*第页< 0.05.G公司，齿状回匀浆的Western blot定量。实验结束时收集了组织，如A类和B类在AS治疗的大鼠中，Arc的表达显著降低，但β-actin、α-CaMKII或PSD-95的表达没有显著降低(*第页< 0.05). 下面是典型的免疫印迹。+表示齿状回灌注；−表示对侧非融合齿状回。H（H），在实验结束时对齿状回进行了显微解剖，如C和D类和匀浆样品进行定量Western blot分析。平均值±SEM变化表示为as-处理与SC-处理齿状回(*第页< 0.05;n个=所有组6–7）。代表性免疫印迹如下所示表示齿状回灌注；−表示对侧非融合齿状回。
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