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.2007年8月22日；27(34):9220-32.
doi:10.1523/JNEUROSCI.2617-07.2007。

不同种类的α-同核蛋白低聚物诱导钙内流和种子

卡琳·M·丹泽尔 1, 多萝西娅·哈森, 安妮·卡罗, 西蒙·穆萨德, 马蒂亚斯·哈贝克, 阿明·吉斯, 汉斯·克雷茨施马尔, 巴斯蒂安·亨格勒, 马库斯·科斯特卡
附属机构

不同种类的α-同核蛋白低聚物诱导钙内流和种子

卡琳·M·丹泽尔等。 神经科学. .

摘要

α-同核蛋白（alpha-syn）的聚集与帕金森病（PD）和其他神经退行性疾病的发病机制有关。越来越多的证据表明，室前低聚物和原纤维，而不是α-同步蛋白的成熟纤维，是帕金森病的致病物种。尽管在研究α-同步肽的低聚物化方面做出了大量努力，没有研究直接在单粒子水平上比较不同的低聚物种类，并研究它们对细胞的生物效应。在本研究中，我们应用了一种新型的高灵敏度单分子检测系统，该系统可以直接比较不同的低聚物类型。此外，我们还研究了不同低聚物类型对细胞的生物效应。为此，我们开发了新的齐聚协议，使这些不同的齐聚物能够用于细胞培养。我们发现，我们所有的三种聚合协议都导致了低聚物的异质群体。一些类型的低聚物通过一种可能的成孔机制破坏细胞离子稳态而导致细胞死亡。其他低聚物类型可以直接进入细胞，导致α-同步蛋白聚集增加。根据我们的结果，我们提出在各种生理条件下，低聚物形式的异质种群将在平衡状态下共存。这些不同的低聚物类型直接或间接导致细胞损伤。我们的数据表明，抑制早期α-同步蛋白聚集事件将因此阻止所有α-同步肽低聚物相关的毒性。这对开发治疗PD和其他联核蛋白病的疾病修饰药物具有重要意义。

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数字

图1。
图1。
α-syn低聚物（A1和A2型）的长期培养特性。A类，FIDA分析两种低聚物α-syn形式在50 m长时间培养（6 d）后产生米磷酸钠缓冲液。已计算出氯化亚铁的影响（A1型无氯化亚铁，A2型有氯化亚铁）。显示了五次测量的平均值±SEM。B类，A1型和A2型寡聚α-syn型的AFM图像（500×500 nm），在50 m内长期培养（6 d）后生成米磷酸钠缓冲液。切片分析显示，球状或原纤维低聚物的高度为2至6纳米。此外，在A1和A2型低聚物中都发现了环状结构（箭头）。AFM图像是几种独立低聚物制剂的AFM图像的代表性示例。
图2。
图2。
搅拌棒产生的α-顺式低聚物类型B1和B2的表征。A类，单颗粒分析揭示了搅拌棒产生的两种低聚物形式。已计算出氯化亚铁的影响（B1型无氯化亚铁，B2型有氯化亚铁）。B类，AFM图像（1μm2)用搅拌棒产生的两种低聚物形式。通过切片分析，低聚物呈现出高度为3至23 nm的异质粒子群。与B2型低聚物相比，B1型低聚物呈更紧密的球形。AFM图像是独立低聚物制剂的几个AFM图像的代表性例子。
图3。
图3。
α-合成低聚物（C1和C2型）的表征。A类，通过过夜培养和超滤产生的两种低聚物α-syn形式的单体分析。分析了氯化亚铁的影响（C1型无氯化亚铁，C2型有氯化亚铁）。B类，AFM图像（1μm2)通过过夜培养和超速离心产生的两种低聚α-syn形式。图像显示球状和原纤维低聚物结构的高度为4–10 nm。使用AFM分析，C1型和C2型低聚物之间没有明显的形态差异。AFM图像是几种独立低聚物制剂的AFM图像的代表性示例。
图4。
图4。
[加利福尼亚州2+]SH-SY5Y细胞中A1和A2型α-syn低聚物的升高。痕迹显示[Ca2+]-单个SH-SY5Y细胞过度表达α-syn[wt]对6μ米离子霉素、0.1 mg/ml单体和0.1 mg/ml A1和A2型低聚物，以及各自的溶剂对照。A1和A2型低聚物引起细胞内[Ca]的明显增加2+]. 荧光记录显示了从施用时间点开始对不同处理的典型反应。细胞的插入图像是在追踪过程中显示的时间拍摄的，用假彩色标尺描绘，彩虹标尺上的“暖色”对应于更高的荧光。插图显示了单个单元格的代表。
图5。
图5。
[加利福尼亚州2+]初级神经元中A1和A2型α-syn低聚物的升高。痕迹显示[Ca2+]-单个皮层神经元对6μg的依赖性荧光反应米离子霉素、0.1 mg/ml单体和0.1 mg/ml A1和A2型低聚物，以及各自的溶剂对照。A1和A2型低聚物引起细胞内[Ca]的明显增加2+]. 荧光记录显示了从施用时间点开始对不同处理的典型反应。插图中的图像显示了单个细胞的伪彩色代表，这些细胞是在轨迹指示的时间捕获的。
图6。
图6。
由A1和A2型低聚物诱导的膜电位的去极化。A类，动力学图显示了0.1μg/μlα-合成单体、A1和A2型低聚物以及500μg/ml禾本科菌素作为阳性对照的典型信号响应。A1和A2型低聚物显示出明显的膜电位去极化。每道显示阴性对照校正平均荧光1.25×105初级神经元。B类与溶剂对照组相比，A1和A2型寡聚物诱导初级神经元去极化时荧光强度的量化。数值为平均值±SEM；n个= 3; *第页<0.002，一个样本吨根据假设值0进行测试。A1处理的神经元：Δ=286.8（95%CI，277.4-296.2）；A2处理的神经元：Δ=345.2（95%CI，286.2–404.2）。
图7。
图7。
A1和A2型α-Syn低聚物诱导细胞内[Ca2+]细胞外钙内流增加2+]来源。A类，动力学图，说明0.1μg/μl A1和A2型α-合成低聚物和阳性对照物的典型信号响应，1.5μ米[Ca中的离子霉素和500μg/ml的革兰菌素2+]-游离细胞外缓冲液。每条痕迹显示6000个模拟转染SH-SY5Y细胞表达内源性α-syn的平均荧光。细胞内[Ca2+]当细胞在[Ca中孵育时，A1、A2和革兰菌素低聚物诱发的信号被完全消除2+]-游离细胞外缓冲液，而离子霉素诱导[Ca2+]信号持续存在。B类，[钙2+]A1和A2型低聚物诱发的信号不被钴（一种非特异性钙）减少2+通道阻滞剂。在有钴和无钴的情况下添加A1型低聚物后，每条示踪显示6000个模拟转染SH-SY5Y细胞的典型平均荧光。A型低聚物在细胞内[Ca2+]. 该实验重复了两次，结果相似。
图8。
图8。
A1和A2型α-合成低聚物的毒性。A类，根据相应溶剂对照标准化caspase-3活性的量化；数值为平均值±SEM；n个= 3. 用0.1 mg/ml A1和A2型低聚物处理模拟转染的SH-SY5Y细胞或过表达α-syn突变体A53T的细胞，导致胱天蛋白酶3的显著激活[未配对吨测试*第页与相应溶剂对照的数据相比，<0.05；A1型低聚物处理：模拟，Δ=151（95%CI，83.3–218.6）；α-syn[A53T]，Δ=75.8（95%置信区间，5.8–145.9）；A2型低聚物处理：模拟，Δ=90.9（95%CI，54.6–127.2）；α-syn[A53T]，Δ=288.9（95%置信区间，147.3–430.5）]。B类，根据相应溶剂控制标准化细胞数量减少的量化。数值显示为平均值±SEM；n个= 3. A1型寡聚体在模拟转染和稳定过度表达突变型α-syn[A53T]SH-SY5Y细胞系上均诱发细胞数量显著减少。A2型寡聚物导致突变型α-syn[A53T]SH-SY5Y细胞过度表达，细胞数量显著减少[未配对吨测试*第页与相应溶剂对照的数据相比，<0.05；A1型低聚物处理：模拟，Δ=−56（95%CI，−91.5至−20.5）；α-syn[A53T]，Δ=−79.3（95%CI，−104.9至−53.62）；A2型低聚物处理：模拟，Δ=−34.6（95%CI，−75.6至−6.5）；α-syn[A53T]，Δ=−72.1（95%CI，−99.4至−44.7）。这两种低聚物类型在24小时后均介导其毒性，不显著。
图9。
图9。
B1和B2型α-合成低聚物的种子效应。用0.1 mg/ml Alexa-488标记的B1和B2型低聚物（绿色）或溶剂对照物处理后，用ASY-1抗体（红色）对α-syn进行免疫细胞化学染色。A类,B类共聚焦图像显示稳定过度表达α-syn[A53T]的SH-SY5Y中α-syn的细胞质染色减少，细胞相关聚集物（种子）增加(A类)或模拟转染SH-SY5Y，内源性表达α-syn(B类)用B2型低聚物处理时。B2型寡聚物比B1型寡聚物具有更高的种子聚集形成潜力。该实验重复了两次，结果相似。
图10。
图10。
C1和C2型α-同低聚物的种子效应。显示了用0.1mg/ml Alexa-488标记的C1和C2型低聚物（绿色）或溶剂对照处理后，ASY-1抗体（红色）对α-syn的免疫细胞化学染色。A类,B类共聚焦图像显示，稳定过度表达α-syn突变体A53T的SH-SY5Y中，α-syn的细胞质染色减少，细胞相关聚集物（种子）增加(A类)或模拟转染的SH-SY5Y细胞(B类)用C2型低聚物处理。C2型寡聚物比C1型寡聚物更有可能触发聚集物的形成。该实验重复了两次，结果相似。C类此外，初级皮质神经元的α-syn（红色）细胞质染色减少，显著的细胞相关α-syn-聚集物形成（黄色）。
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