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.2007年8月；117(8):2133-44.
doi:10.1172/JCI31807。

Foxo3是红细胞生成中调节氧化应激所必需的

德拉甘·马里科维奇 1, 张欣（Xin Zhang）, 萨法克·亚尔钦, 茱莉亚·P·卢西亚诺, 卡洛·布鲁格纳拉, 塔拉·胡贝尔, 萨吉·加法里
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Foxo3是红细胞生成过程中调节氧化应激所必需的

德拉甘·马里科维奇等。 临床研究杂志. 2007年8月.

摘要

红细胞在成熟时积累血红蛋白，因此极易受到氧化损伤。然而，红系细胞抗氧化防御的转录控制机制迄今为止还没有得到很好的表征。我们观察到，叉头盒O3（Foxo3）转录因子缺乏的动物在暴露于红系氧化应激诱导的条件下时迅速死亡，而野生型小鼠的生存能力没有下降。鉴于这一惊人的发现，我们研究了Foxo3在红细胞生成中ROS调节中的潜在作用。在正常红细胞成熟过程中，Foxo3表达、核定位和转录活性均增强。Foxo3缺乏的红细胞表现出活性氧清除酶表达降低，并具有活性氧介导的寿命缩短和氧化损伤的证据。此外，Foxo3的缺失诱导红系前体细胞有丝分裂停滞，导致体内红系成熟率显著降低。我们确定ROS介导的p21上调（CIP1/WAF1/Sdi1）（也称为Cdkn1a）是Foxo3-缺陷红系前体细胞中干扰细胞周期进展的主要因素。这些发现确立了Foxo3在调节红细胞氧化应激、细胞周期、成熟和寿命方面的重要非冗余功能。这些结果可能会影响对ROS发挥作用的人类疾病的理解。

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数字

图1
图1。高氧化应激福克斯3–/–红细胞。
(A类)野生型Kaplan-Meier生存曲线和福克斯3–/–老鼠(n个=每组6例），单剂量腹腔注射苯肼（PHZ；100 mg/kg）。P（P）<0.0001，log-rank检验；显示了2个独立实验中的1个。(B类)WT和中的ROS测量福克斯3–/–红细胞（注意没有任何外源性添加的过氧化物）。(C类)结果直方图B类（平均值±SEM，n个= 6; **P（P）< 0.02). (D类)红细胞中的蛋白质氧化。DNPH，2,4-二硝基苯肼。(E类)WT氧化状态的定量分析(n个=3）和福克斯3–/–(n个=4）红细胞（通过比较车道的信号强度）D类使用BandScan软件版本4.5（Glyco）*P（P）<0.05，学生的t吨测试。
图2
图2。红细胞寿命缩短福克斯3–/–老鼠。
(A类)通过体内生物素标记测定红细胞寿命。第0天，95%的红细胞被标记。每5天给动物放血一次，并用流式细胞仪对存活的标记细胞进行分析。(B类)网织红细胞指数在福克斯3–/–和WT小鼠。结果代表平均值±SEM；n个每组6个*P（P）<0.05时**P（P）<0.01，学生t吨测试。
图3
图3。活性氧诱导红细胞寿命缩短福克斯3–/–老鼠。
(A类)体内NAC治疗可提高红细胞的寿命福克斯3–/–老鼠。WT和福克斯3–/–给小鼠腹腔注射NAC（100 mg/kg）或PBS，每周3次；3周后，红细胞在体内被生物素化，红细胞寿命如图2所示，而NAC（或PBS）治疗继续3周。(B类)6周后测量所有小鼠的网织红细胞指数。显示了两个独立实验中的一个。结果表示平均值±SEM，n个=每组6人*P（P）< 0.05.
图4
图4。在成红细胞成熟过程中，Foxo3表达上调。
(A类)胚胎和成人造血器官中Foxo1、Foxo3和Foxo4的QRT-PCR分析。所示为三个独立实验的代表性结果，实验重复进行。(B类)骨髓内源性FoxO蛋白表达的Western blot分析。过度表达FOXO1、FOXO3a和FOXO4 cDNA的HEK293T细胞的蛋白裂解物用作阳性对照。(C类)根据CD71和TER119的表达，对流式细胞术分离的胎肝亚群的指示转录物进行QRT-PCR分析。注意，Foxo3在最成熟的红细胞亚群（CD71）中的表达最高–TER119（终端119）+). 三次独立实验的代表性结果显示为平均值±SEM。细胞从双CD71分化–TER119（终端119）–富含造血祖细胞（包括红系祖细胞）至CD71的细胞亚群+TER119（终端119）–主要含有原红细胞和嗜碱性红细胞的细胞，然后是CD71+TER119（终端119）+富含嗜碱性/嗜多色成红细胞的细胞，并最终形成CD71–TER119（终端119）+主要由正常细胞组成的细胞。(D类)富含祖细胞的胎肝亚群中Foxo3的Western blot分析（TER119–)红细胞前体（TER119+，成红细胞）使用抗FOXO3a抗体。使用抗GATA-1（N6）和抗β-肌动蛋白抗体作为对照。
图5
图5。Foxo3转位到细胞核并调节初级胎肝红细胞中抗氧化酶的转录。
(A类)使用抗FOXO3a抗体对新鲜分离的E14.5胎肝红细胞亚群中的Foxo3（红色）进行免疫荧光染色，并用核DAPI（蓝色）对样品进行复染。(B类)CD71中核Foxo3的定量–TER119（终端119）–与CD71相比的细胞–TER119（终端119）+细胞。数据分析来自每个亚群平均50个细胞A类. (C类)研究Foxo3在有核深红色荧光剂（DRAQ5）阳性细胞中的表达。DRAQ5型+CD71型–TER119（终端119）–和DRAQ5+CD71型–第119页+这些细胞是从E14.5胎肝中分离出来的FACS细胞，并使用抗FOXO3a抗体（绿色）进行免疫荧光染色。(D类)结果的量化C类显示每个亚群中至少50个细胞的平均值±SEM***P（P）<0.001，学生t吨测试。(E类)FACS分类的红细胞前体亚群CD71+TER119（终端119）–和CD71+TER119（终端119）+用含有5个串联重复序列FoxO结合位点（pTA-FoxO5BS-Luc）或突变体（pTA-FoxO5BS Smut-Luc，然后在Epo（2 U/ml）（28，39）存在下培养，36小时后分析荧光素酶活性。EKLF报告子（pEKLF-Luc）（56）作为阳性对照。代表至少4个独立实验（一式三份）归一化结果的数据显示为平均值±SEM**P（P）< 0.01;†P（P）< 0.002;#P（P）< 0.0001. (F类)胎儿肝红细胞前体成熟过程中Foxo3的转录活性。第119页–用含有2个FoxO结合位点（pSod-Luc）或其突变株（pSod-DBE12mut-Luc）的空荧光素酶报告子（pGL-3）或SOD2荧光素瘤报告子瞬时转染胎肝细胞（富含祖细胞），并如上所述进行培养，在24和48小时测定荧光素酶活性。结果显示为平均值±SEM；n个=每组4人。
图6
图6。有丝分裂阻滞福克斯3–/–红系前体细胞。
(A类)左图：活WT和福克斯3–/–根据CD71和TER119表达的骨髓红细胞前体。盖茨一世至四世描述了成熟度不断提高的红细胞群体。门的数字表示该门内单元分布的百分比。票据减少福克斯3–/–成熟红细胞（门IV）和福克斯3–/–闸门II中的前体与WT的比较（显示了9个实验的代表性流式细胞术分析）。右：CD71细胞周期分布的代表性分析+TER119（终端119）+来自6个独立实验的细胞（门II）。(B类)闸门IV与闸门II的比率A类(n个=9，平均值±SEM**P（P）<0.01，学生t吨测试）。(C类)左面板II号门细胞的细胞周期分析A类(n个=6，平均值±SEM***P（P）<0.001，学生t吨测试）。WT和Foxo3缺陷型CD71+TER119（终端119）+使用Hoechst对（门II）骨髓红细胞进行FACS分类和细胞周期分布分析(A类、右侧面板和C类). 显示了细胞周期G1、S和G2/M期的细胞百分比(n个=6，平均值±SEM***P（P）<0.001，学生t吨测试）。其他亚群的细胞周期分析没有发现显著差异。
图7
图7。Foxo3-缺陷红细胞的氧化应激状态。
(A类)新分离的FACS分选的中间红细胞（CD71）中细胞周期调节基因的QRT-PCR分析+TER119（终端119）+)野生型和Foxo3缺乏骨髓细胞的分化阶段。注意p21的上调CIP1/WAF1/Sdi1级中间成红细胞（CD71+TER119（终端119）+电池与图6A的栅极II所示相同）。(B类)左：同一细胞中p53表达的QRT-PCR分析A类右：WT和Foxo3缺陷骨髓TER119中的p53报告荧光素酶活性–转染后36小时的细胞和体外培养，如图5，E和F所示。2个独立实验的代表。(C类)同一人群抗氧化基因的QRT-PCR分析A类注意p53下游抗氧化剂目标GADD45和SESN2的上调。重复或多次进行的4个独立实验的代表*P（P）<0.05，学生的t吨测试。
图8
图8。ROS诱导的第21页CIP1/WAF1/Sdi1级.
第119页–骨髓细胞在有或无100μM NAC的情况下培养第21页CIP1/WAF1/Sdi1级36小时后用QRT-PCR检测*P（P）<0.05学生t吨测试。
图9
图9。抗氧化酶的表达需要Foxo3。
骨髓成红细胞抗氧化酶（TER119）的QRT-PCR分析+)单元格。GPX1，谷胱甘肽过氧化物酶1。n个= 3; *P（P）<0.05时**P（P）<0.02，学生的t吨测试。
图10
图10。苯肼引起的祖细胞后成红细胞缺陷反应福克斯3–/–老鼠。
用苯肼（100 mg/kg）或PBS处理WT和Foxo3缺陷小鼠，24小时后处死。(A类)流式细胞术分析骨髓、脾脏和血液中成熟成红细胞的相对频率，通过成熟红细胞比率（CD71）计算–TER119（终端119）+)至总成红细胞（CD71+TER119（终端119）+和CD71–TER119（终端119）+).n个=每组3人*P（P）<0.05，学生的t吨测试。(B类)红细胞中ROS浓度的测量（TER119+单元格）。#P（P）< 0.01; **P（P）< 0.001.
图11
图11。红细胞生成中Foxo3亚细胞定位调控模型。
抑制EpoR信号，包括抑制PI3-激酶/AKT通路，这是EpoR对成红细胞的下调以及血红蛋白积累的结果，可能导致ROS信号，导致Foxo3核定位和活化。
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