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比较研究
.2007年7月25日；27(30):7974-86.
doi:10.1523/JNEUROSCI.0006-07.2007。

hsf1缺陷小鼠的中枢神经系统疾病特征：脱髓鞘、星形胶质细胞增生和泛素化蛋白的积累

Sachiko Homma公司 1, 金雄杰, 王广虎, 那欣图, 金娜·敏, 内森·亚纳萨克, 纳希德·米维奇
附属公司
比较研究

脱髓鞘、星形胶质细胞增生和泛素化蛋白的积累是hsf1缺陷小鼠中枢神经系统疾病的标志

Sachiko Homma公司等。 神经科学. .

摘要

热休克转录因子（Hsfs）负责热休克反应，这是一个进化上保守的清除受损和聚集蛋白质的过程。在含有单个Hsf的生物体中，如秀丽隐杆线虫，Hsf水平的降低与年龄相关表型的出现和蛋白质聚集体的增加有关。哺乳动物细胞表达三种hsfs（hsf1、hsf2、hsf4），它们在中枢神经系统稳态中的作用尚不清楚。在本研究中，我们使用突变小鼠检测了CNS中单个或多个hsf基因缺失的影响。我们的结果表明，hsf1-/-小鼠表现出伴随严重星形胶质细胞增生的进行性髓鞘丢失，并且在缺乏hsf2或hsf4基因的情况下，这种情况会加剧。磁共振成像和行为研究表明，老年hsf1-/-小鼠胼胝体白质束减少，运动活动不足。同时，hsf1-/-老化的中枢神经系统表现出活化的小胶质细胞和凋亡细胞增多，这些细胞主要对GFAP（一种星形胶质细胞特异性标记物）呈阳性。基于活hsf1-/-细胞中短寿命泛素化绿色荧光蛋白（GFPu）表达的研究表明，它们降解泛素化蛋白、积累短寿命GFPu和积累含有三核苷酸重复序列（Q103-GFP）的GFP亨廷顿模型聚集体的能力降低。同样，hsf1-/-脑和星形胶质细胞的泛素化蛋白水平高于野生型，蛋白质氧化水平增加，对氧化应激的敏感性增加。这些研究表明，哺乳动物hsf基因，特别是hsf1基因，在生物体生命周期内的质量控制机制和CNS稳态维持中发挥着关键作用。

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数字

图1。
图1。
脱髓鞘和星形胶质细胞增生热休克因子1−/−老鼠。A类,B、野生型（WT）脊髓（整个或后索）颈部横截面，热休克因子1,hsf2（高速f2）,hsf4型,hsf1hsf2,hsf2高速f4，或hsf1hsf4型-8周龄缺陷小鼠。用MBP、GFAP或NeuN抗体免疫组化染色后分析组织切片。比例尺：MBP，50μm；GFAP，500μm；NeuN，100μm。C类野生型（WT）脊髓（后索）高倍放大热休克因子1−/−小鼠显示髓磷脂的Luxol Fast Blue（LFB）染色在热休克因子1−/−鼠标（箭头）。比例尺，50μm。C类、底板、脊髓横截面热休克因子1−/−小鼠MBP免疫染色。p、 a和l表示脊髓的三个区域：p，后索；a、 前索；l，侧索。p和l表示MBP免疫染色减少的区域热休克因子1−/−脊髓。右侧面板显示左侧面板中显示的侧索部分的放大倍数较高。右侧面板中的箭头表示髓鞘脱髓鞘（MBP染色较少）和空泡状髓鞘。比例尺：左面板，100μm；右侧面板，50μm。
图2。
图2。
年龄依赖性星形胶质细胞增生症热休克因子1−/−老鼠。A类,B，野生型（WT）脊髓颈区横截面，热休克因子1-，hsf2（高速f2）-,hsf4型-,hsf1hsf2-,hsf2hsf4-，或hsf1hsf4型-用GFAP免疫染色的8周龄缺陷小鼠(A类)（红色荧光）和星形胶质细胞数量（每平方毫米）的定量分析热休克因子-P0、P18和8周龄或3-5个月龄的缺陷小鼠(B) (n个=5只小鼠）。比例尺，50μm。细胞核用DAPI染色（蓝色）。C类,D类P0、P18、8周龄或3-5月龄野生型或热休克因子1−/−使用NG2或NeuN抗体的小鼠。对每平方毫米切片中免疫阳性细胞的数量进行量化和报告(n个=3只小鼠）。误差条表示SEM。
图3。
图3。
电子显微镜分析热休克因子1−/−随着年龄的增长，脊髓出现脱髓鞘。A类野生型（WT）脊髓胸段（前索）横截面的电子显微镜分析(一)或热休克因子1−/−(b条)14周龄小鼠，或WT(c（c）)或热休克因子1−/−(d日)在8个月大时。中的箭头一和b条表明年轻人存在髓鞘减少的轴突热休克因子1−/−老鼠和箭头c（c）和d日表明老年人存在髓鞘减少的轴突热休克因子1−/−老鼠。比例尺，1μm。B，在用野生型或热休克因子1−/−14周龄和8个月龄的小鼠，图表以髓磷脂减少的轴突百分比报告。请注意，髓鞘减少的轴突大多是直径在1至5μm之间的轴突。>5μm轴突中的髓鞘受影响较小。轴突数量<1μm热休克因子1−/−与野生型小鼠相比，小鼠数量减少。误差条表示SEM。
图4。
图4。
年龄依赖性退行性变热休克因子1−/−大脑。A类,B使用GFAP抗体对大脑冠状部（胼胝体和侧脑室，虚线）进行免疫组织化学染色(A类)（红色荧光灯）或MBP(B)来自野生型（WT）和热休克因子1−/−如图所示，8周龄或1-1.5岁的小鼠。的底部面板A类盒子区域的放大倍数更高。中的箭头A类描绘星形胶质细胞增多的区域热休克因子1−/−大脑。中的箭头B显示脱髓鞘区域热休克因子1−/−大脑与野生型相比。放大倍数：A类、25×（顶部）、100×（中部）、250×（底部）；B, 400×. 核A类已用DAPI（蓝色）染色。
图5。
图5。
老年人热休克因子1−/−磁共振成像分析显示小鼠出现结构异常。A类野生型（WT）或热休克因子1−/−1.5岁的小鼠。B、野生型和非野生型MRI图像中侧脑室和第三脑室（V）的定量（相对单位）热休克因子1−/−大脑。条形图表示中值。这个第页总心室率的值热休克因子1−/−小鼠显著大于野生型（=0.05）。这个第页左心室和总侧心室的值热休克因子1−/−小鼠显著大于野生型（=0.05）。这个第页背侧和第三脑室的数值热休克因子1−/−小鼠显著大于野生型（=0.05）。请注意，一些心室容积测量值是相关的。白色条，野生型；填充钢筋，热休克因子1−/−.
图6。
图6。
中GFAP和MBP水平的变化热休克因子1−/−大脑。A类,B、对10周龄野生型（WT）的大脑总提取物（30μg）或从大脑不同区域制备的提取物（30微克）进行免疫印迹分析，或热休克因子1−/−小鼠检测GFAP、MAG（髓磷脂相关糖蛋白）、MBP或PLP。MBP含有多种亚型。β-肌动蛋白显示为负荷控制。
图7。
图7。
衰老过程中的运动缺陷热休克因子1−/−老鼠。A类，照片显示了12至18个月龄野生型（WT）和热休克因子1−/−小鼠酒吧测试。B，将2周至18个月大的小鼠的数据绘制为小鼠能够抓住横杆的时间（以秒为单位）。星号表示热休克因子1−/−老鼠们能够在酒吧里坚持很长一段时间(第页<0.05）时间短于同年龄组的野生型小鼠。误差条表示SEM。
图8。
图8。
OPC正常增殖热休克因子1−/−老鼠。野生型（WT）脊髓横截面BrdU标记（绿色荧光）和NG2（红色荧光）OPCs的免疫荧光分析热休克因子1−/−P10的小鼠。比例尺，50μm。
图9。
图9。
中枢神经系统凋亡细胞增多热休克因子1−/−老龄小鼠。A–C用CC1、NeuN或GFAP抗体对脊髓颈部切片进行免疫组织化学染色，分别检测少突胶质细胞、神经元或星形胶质细胞。凋亡细胞用TUNEL（红色荧光）染色。合并是TUNEL、特定染色（绿色荧光）（如每个面板所示）和DAPI（蓝色荧光）（检测细胞核）的重叠。比例尺，100μm。B显示从野生型或热休克因子1−/−1.5岁的小鼠*第页< 0.05.C类显示TUNEL阳性细胞的定量A类所示的每种电池类型。误差条表示SEM。
图10。
图10。
反应性胶质增生症热休克因子1−/−老龄小鼠。A类,B，8周龄或1岁野生型或热休克因子1−/−使用Mac3抗体的小鼠。比例尺，50μm。数据定量见B误差条表示SEM。
图11。
图11。
热休克因子1−/−细胞表现出泛素-蛋白酶体途径的缺陷。A类瞬时转染野生型或热休克因子1−/−表达含有Ub-M-GFP或Ub-R-GFP的构建物的MEF与含有β-半乳糖苷酶的质粒共转染，作为转染频率的内部控制。GFP阳性细胞显示在每个象限的顶部面板中。显示荧光平均强度和阳性细胞百分比。B，样品中等量的蛋白质（30μg）A类用GFP或β-肌动蛋白抗体进行免疫印迹分析，以控制负荷。表达Ub-M-GFP或Ub-R-GFP的野生型MEF（分别为车道1和2）和热休克因子1−/−显示了表示Ub-M-GFP或Ub-R-GFP的MEF（分别为车道3和车道4）。C类、Wild-type或热休克因子1−/−MEF瞬时转染编码Ub-R-GFP的质粒。48小时后，用[35S] 蛋氨酸2小时。然后将细胞冲洗并在新鲜培养基中追逐指定的时间。使用GFP抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并对适当的条带进行定量，以确定是否存在[35S] 蛋氨酸。这个年-轴表示[35S] 在标记期结束时，蛋氨酸与原始标记蛋白相比仍然存在。
图12。
图12。
热休克因子1−/−细胞表现出聚谷氨酰胺重复蛋白的聚集增加。A类,C类、野生型或热休克因子1−/−用含有polyQ25-GFP或polyQ103-GFP的表达载体瞬时转染MEF。将转染细胞固定在4%多聚甲醛中15分钟，并用荧光显微镜观察(A类). 野生型或热休克因子1−/−细胞被量化(C类). 误差条表示SEM。B、流式细胞术分析野生型或热休克因子1−/−用含有polyQ25-GFP或polyQ103-GFP和β-半乳糖苷酶的表达载体瞬时转染48小时后的MEF，作为转染频率的内部控制。顶部面板显示了野生型与热休克因子1−/−表达Q25GFP或Q103-GFP的细胞。底部两个面板显示每个象限顶部面板中野生型GFP阳性细胞（和百分比）与热休克因子1−/−表达Q25GFP或Q103-GFP的细胞。
图13。
图13。
泛素化蛋白在热休克因子1−/−大脑和原代星形胶质细胞。免疫印迹分析（30μg），使用抗体检测从野生型或热休克因子1−/−8周龄小鼠（用于大脑总提取物）或E18（用于神经元培养）或P2（用于星形胶质细胞培养）。此外，还对暴露于缺氧（0%氧气）2小时后的样品进行了免疫印迹分析。β-肌动蛋白作为负荷对照。
图14。
图14。
泛素化蛋白在细胞浆中的积累热休克因子1−/−初级星形胶质细胞暴露于缺氧。A类,B，从野生型或热休克因子1−/−使用GFAP（红色荧光）或泛素（绿色荧光）抗体的小鼠。细胞核用DAPI（蓝色）染色。星形胶质细胞培养自野生型或热休克因子1−/−P2的室友。培养7天后，星形胶质细胞暴露于常氧(A类)或缺氧2小时(B). 细胞用4%多聚甲醛固定并进行免疫染色。放大倍数，400×。C类细胞核或细胞质中GFAP和泛素染色的细胞定量*第页< 0.05. 注意，在非应激条件下，泛素免疫染色主要是核染色，但应激后染色更多是细胞质染色。有趣的是，热休克因子1−/−缺氧2h后，星形胶质细胞胞浆中泛素染色明显增多，出现间断(B，箭头），表明可能存在泛素化/聚集蛋白质。误差条表示SEM。
图15。
图15。
死亡人数增加热休克因子1−/−缺血或缺氧后的星形胶质细胞。A类，星形胶质细胞在野生型或热休克因子1−/−室友。培养7天后，来自野生型或热休克因子1−/−将小鼠暴露于缺血（OGD）、缺氧（0%氧气）或GD中4或8小时。使用MTT分析测定星形胶质细胞活性*第页< 0.05.B，从E18野生型和热休克因子1−/−将小鼠和小鼠暴露于缺氧（0%氧气）下2h，并按照A类误差条表示SEM。
图16。
图16。
蛋白质氧化水平升高热休克因子1−/−大脑。A类、野生型（WT）脑提取物的免疫印迹分析，热休克因子1+/−，或热休克因子1−/−5个月大的小鼠。通道1和通道2是野生型小鼠的大脑提取物；3号通道是从热休克因子1+/−小鼠；4–7号通道是大脑提取物热休克因子1−/−老鼠。B、未经处理的初级星形胶质细胞（由P2制备）和神经元（由E18制备）培养物（由WT制备，或热休克因子1−/−老鼠。车道1和车道2摘自野生型和热休克因子1−/−神经元；泳道3和4是来自野生型和热休克因子1−/−星形胶质细胞。根据OxyBlot氧化蛋白检测试剂盒制备细胞提取物；分离30μg蛋白质，并使用DNP抗体检测氧化蛋白质（Halliwell和Gutteridge，1990）。试剂盒中提供了对照氧化分子量标记作为阳性对照。β-肌动蛋白作为负荷对照。
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