Identification of the domains of the influenza A virus M1 matrix protein required for NP binding, oligomerization and incorporation into virions

doi:10.1099/vir.0.82809-0

.2007年8月；88（第8部分）：2280-2290。

doi:10.1099/vir.0.82809-0。

甲型流感病毒M1基质蛋白NP结合、寡聚和并入病毒所需结构域的鉴定

莎拉·诺顿¹, 伊丽莎白·梅德卡夫¹, 道恩·费舍尔¹, 安妮·穆林¹, 黛布拉·埃尔顿¹, 保罗·迪加德¹

附属公司

PMID： 17622633
预防性维修识别码：项目经理2884976
内政部： 10.1099/版本0.82809-0

甲型流感病毒M1基质蛋白NP结合、寡聚和并入病毒所需结构域的鉴定

莎拉·诺顿等。 J Gen Virol公司. 2007年8月.

.2007年8月；88（第8部分）：2280-2290。

doi:10.1099/vir.0.82809-0。

作者

莎拉·诺顿¹, 伊丽莎白·梅德卡夫¹, 道恩·费舍尔¹, 安妮·穆林¹, 黛布拉·埃尔顿¹, 保罗·迪加德¹

隶属关系

¹英国剑桥大学病理学系病毒学系，剑桥CB2 1QP网球场路。

PMID： 17622633
预防性维修识别码：项目经理2884976
内政部： 10.1099/版本0.82809-0

摘要

甲型流感病毒的基质（M1）蛋白是一种多功能蛋白，在病毒生命周期中发挥重要的结构和功能作用。它驱动病毒出芽，是病毒粒子的主要蛋白质成分，在病毒包膜和完整膜蛋白与基因组核糖核蛋白（RNP）之间形成中间层。它也有助于控制RNP的细胞内贩运。这些作用主要通过与病毒和可能的细胞蛋白质的蛋白质-蛋白质相互作用介导。在此，确定了M1参与结合病毒RNP和介导同源寡聚化的区域。在体外，通过使用重组蛋白，发现M1的中间结构域负责结合NP，并且这种相互作用不需要RNA。类似地，只有含有中间结构域的M1多肽能够与从纯化病毒中分离的RNP-M1复合物结合。当检测M1自结合时，蛋白质的所有三个结构域都参与了同源寡聚化，尽管中间结构域仍然占主导地位，并且在没有N端和C端结构域的情况下有效地自结合。然而，当M1的单个片段被绿色荧光蛋白标记并在病毒感染的细胞中表达时，丝状颗粒的显微镜显示，只有全长M1被整合到萌芽病毒中。结论是，M1的中间结构域主要负责结合NP和自结合，但需要额外的相互作用才能有效地将M1并入病毒颗粒。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
M1的结构域和NP结合活性。（a）结晶学定义的M1结构域结构示意图（坐标为氨基酸数）以及本研究中使用的细分。图中还显示了RKLKR基序在结合RNA和NEP中的重要位置。（b–d）GST的NP结合活性，指示的GST-M1融合蛋白或GST-NP（NP）。[³⁵S] 甲硫氨酸标记，*在体外*-翻译NP（b，c）或纯化NP（d）与6用SDS-PAGE和（b）考马斯蓝染色（以可视化输入的GST融合蛋白），（c）放射自显影或（d）用抗NP进行Western blot分析，分析连接到谷胱甘肽-Sepharose微球和结合材料上的每种融合蛋白μg。等分样品相当于输入可溶性NP的四分之一（总量的1/4）还对其进行了分析，以指导结合效率。左侧显示分子质量标记，右侧显示特定蛋白质的位置。（c）中可见的约43 kDa放射性标记物种是一个异常NP在体外翻译产品。

**图2。**
定量分析GST-M1融合蛋白的NP-和M1-结合活性。（a）通过密度测定法定量三个独立分析中结合放射性标记的NP或M1与所示GST融合蛋白的量。通过减去仅含GST的任何背景值来校正数值，并根据WT M1结合的量进行标准化，绘制为平均值±标准偏差（b）通过增加所示GST融合蛋白的浓度来结合放射性标记NP的量以类似的方式进行量化，并表示为结合输入物质的百分比。数值来自单个代表性实验，但全长GST–M1除外，其中绘制了三个实验的平均值±范围。

**图3。**
的能力*在体外*-翻译的M1域片段与GST-NP结合。在与GST–NP（N）或GST（G）结合之前（T）或之后，通过SDS-PAGE和放射自显影术分析所示放射性标记多肽的等分样品。分子质量标记显示在左侧；箭头表示M+C和C子片段的预期蛋白质大小。

**图4。**
病毒RNP核心共沉淀分析。所示放射性标签的等分样品，*在体外*-翻译后的M1多肽在有（+）或无（-）洗涤剂破碎病毒的情况下培养，并通过SDS-PAGE和（a）考马斯蓝染色或（b）放射自显影术在（T）前或通过离心分离成颗粒（P）和上清液（S）组分后进行分析。（a）左侧显示分子质量标记，右侧显示特定蛋白质的位置。（c）通过密度测定法量化颗粒部分中M1多肽的百分比。绘制了两个或三个独立实验的平均±范围。

**图5。**
M1的自联想。所示放射性标签的等分样品，*在体外*-翻译的M1多肽在与GST-M1融合蛋白结合之前（T）或之后通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。

**图6。**
过量NP对M1自结合的影响。（a）小份放射性标签，*在体外*-翻译后的WT M1在（T）或与GST–中间结构域（GST–Mid）或GST结合之前或之后，在NP指示量存在的情况下，通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析。（b）结合M1通过密度测定法定量，并绘制（两个独立实验的平均值±范围）相对于NP不存在的结合量。

**图7。**
GFP–M1融合蛋白在MDCK细胞中的表达。用SDS-PAGE分离转染（或模拟转染）表达GFP融合蛋白质粒的细胞的裂解物，并用抗GFP血清进行Western blot分析。分子质量标记显示在左侧。

**图8。**
将GFP–M1多肽并入丝状病毒颗粒。用表达所示GFP融合蛋白的质粒转染细胞，并用PR8/MUd病毒进行重叠感染。感染后12小时，细胞固定，细胞表面用抗PR8血清染色（红色），并成像红色和绿色荧光。所示图像是在细胞上以大约0.5μm的间隔拍摄的合并共焦堆叠的投影（使用Leica TCS-SP软件制作）*xy公司*平面（上面板）和大约0.8μm的间隔*x赫兹*平面（下部面板）。通过使用Adobe Photoshop进行捕捉后处理，以实现图像的日光可视化。棒材，10μm。

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