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.2007年8月；171(2):513-24.
doi:10.2353/ajpath.2007.070188。 Epub 2007年7月9日。

自噬与泛素蛋白酶体系统的联系对于调节内质网应激和细胞活力至关重要

丁文兴 1, 红敏妮, 高文涛, 吉森田松（Tamotsu Yoshimori）, 唐娜·B·斯托兹, 大卫·罗恩, 尹晓明
附属公司

自噬与泛素蛋白酶体系统的联系对于调节内质网应激和细胞活力至关重要

丁文兴等。 美国病理学杂志. 2007年8月.

摘要

细胞中存在两个主要的蛋白质降解系统，泛素-蛋白酶体系统和自噬机制。在这里，我们研究了这两个系统的功能关系和潜在机制。蛋白酶体抑制激活了自噬，表明两者在功能上是耦合的。自噬起到了代偿作用，因为自噬的抑制促进了多泛素化蛋白聚集体的积累。自噬可能是对蛋白酶体抑制期间错误折叠蛋白引起的内质网应激反应而激活的。通过基因缺失或RNA干扰抑制IRE1介导的主要未折叠蛋白反应途径显著抑制蛋白酶体抑制剂的自噬激活。有趣的是，c-Jun NH（2）-末端激酶（JNK）而非XBP-1（两者都是IRE1的已知下游靶点）似乎参与了蛋白酶体抑制剂的自噬诱导。最后，蛋白酶体抑制剂诱导的自噬对于控制内质网应激和减少癌细胞的细胞死亡很重要。因此，我们的研究提供了一种机制观点，并阐明了这两个蛋白质降解系统之间联系的功能意义。

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数字

图1
图1
蛋白酶体抑制导致LC3B-II的积累。A类和B类：用MG132（1μμm）处理Bax阳性和缺失的HCT116细胞不同时间(A类)或以不同剂量持续16小时(B类). 制备总裂解物并进行免疫印迹分析。Atg5被检测为与Atg12的复合物。抄送：Bax缺陷的HCT 116细胞用乳酸菌素（5μmol/L）、ALLN（10μmol/L）或硼替佐米（20 nmol/L）处理24小时，并如上进行免疫印迹分析。医生：用MG132（5μmol/L）处理DU145细胞不同时间，并进行免疫印迹分析。电子邮箱：在氯喹（CQ，2μmol/L）存在或不存在的情况下，用硼替佐米（20 nmol/L）处理Bax缺陷的HCT 116细胞24小时。然后按照指示进行免疫印迹分析。
图2
图2
GFP-LC3B的膜移位对蛋白酶体抑制的反应。答：用GFP-LC3B转染DU145细胞，用载体对照处理(一)或MG132（5μmol/L，b条)24小时，然后用荧光显微镜检查。B类：MG132治疗后点状GFP-LC3B阳性HCT 116（黑柱）、Bax缺乏HCT 116（白柱）和DU145（灰柱）细胞的定量（平均值±SD）。抄送：将稳定表达GFP-LC3B的HCT116-Bax缺陷细胞用载体对照、lactacystin（5μmol/L）、ALLN（10μmol/L）或硼替佐米（20 nmol/L）处理24小时。测定点状GFP-LC3B信号的细胞百分比（平均值±SD）。医生：用GFP-LC3B转染Bax阳性HCT 116细胞，用MG132（1μmol/L）处理24小时，然后用MDC（200μmol/L）染色，荧光显微镜观察。电子邮箱：对经MG132处理的Bax阳性HCT 116（黑柱）、Bax缺乏HCT116（白柱）和DU145（灰柱）细胞中点状MDC阳性细胞的定量*P（P）对照组和治疗组之间的Z检验<0.01。
图3
图3
蛋白酶体抑制剂处理细胞中自噬空泡的电子显微镜检测。答：HCT 116细胞的电子显微照片(一和b条)和DU145电池(c（c）和d日)用MG132（0.1至0.5μmol/L）处理16小时。注意双层膜(一,箭头)或多层膜(d日)AV的结构。箭头也显示AVs与细胞溶质的含量(一)，线粒体(b条)，或ER(c（c）). 比例尺：0.5μm(一)，0.2微米(b条)，0.25微米(c（c）)和0.1微米(d日).B类：每100μm的AV数2在存在或不存在3-MA（10 mmol/L）的情况下，用MG132（分别为0.1和0.25μmol/L）处理Bax缺乏的HCT 116（白柱）和DU145（灰柱）细胞，量化细胞质面积的平均值±SD。*和#P（P）<0.01（*MG132治疗组与对照组相比；#MG132加3-MA与MG132单独）。抄送：用MG132（0.5μmol/L）加或减3-MA（10 mmol/L）处理Bax缺陷的HCT116细胞，并用免疫印迹分析检测LC3B的处理。
图4
图4
抑制自噬增强蛋白酶体抑制剂诱导的癌细胞死亡。答：Bax阳性和Bax缺乏的HCT 116细胞在有（封闭柱）或无（开放柱）3-MA（10 mmol/L）的情况下用MG132处理24小时，然后用Hoechst 33328染色。具有凋亡细胞核特征的细胞被定义为凋亡细胞*P（P）<0.01和$P（P）对于每种MG132剂量和细胞系，通过Z检验，无3-MA组和含3-MA组之间的差异<0.05。B类：用针对特定Atg基因（靶基因）或阴性对照siRNA（Ctrl）的指示siRNA转染Bax缺陷的HCT 116和DU145细胞48小时，然后用不同抗体进行免疫印迹。Atg5被检测为与Atg12的复合物。抄送：Bax缺陷HCT 116（白柱）和DU145（灰柱）细胞转染120 nmol/L抗Atg8/LC3B的siRNA或阴性对照siRNA 36小时，然后用MG132处理。每100μm的AVs数量2然后量化细胞质面积（平均值±SD）。*和#P（P）两种细胞系的单向方差分析均<0.01（*MG132+阴性siRNA与对照组相比；#MG132加siRNA-LC3B与MG132+负siRNA）。D类和电子邮箱：将Bax缺陷的HCT 116细胞转染特定siRNA或阴性对照（Neg），并用MG132（0.25μmol/L）处理16小时。凋亡细胞(D类)被确定为A类. *P（P）Z检验<0.01（MG132加特定siRNA与MG132再加阴性siRNA）。效应器半胱天冬酶活性(E类)以DEVD-AFC为底物进行测量，结果表示为未处理对照组的折叠增加。
图5
图5
抑制自噬会增加癌细胞中泛素化蛋白和聚集物的积累。答：用阴性siRNA（Neg）或抗Atg8/LC3B或Atg6的siRNA转染Bax缺陷HCT 116细胞48小时，然后用MG132（0.5μmol/L）或对照载体处理24小时。裂解液在放射免疫沉淀分析缓冲液中制备，并在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离。用抗泛素（顶面板）和抗β-肌动蛋白（底面板）抗体进行免疫印迹分析。B类和抄送：用指定的siRNA转染HCT 116 Bax缺陷细胞，并用MG132（0.5μmol/L）处理24小时(B类)或如图所示(C类). 然后用4%多聚甲醛固定细胞，并用抗泛素抗体和DNA染料Hoechst 33342染色。分散的泛素化蛋白可以在未处理的细胞的细胞核中检测到，但核周泛素化蛋白聚集体只能在MG132处理的细胞中检测到(箭头). 后者（聚集阳性细胞）被量化并表示为总抗泛素阳性细胞的百分比(C类). *P（P）<0.01和$P（P）Z检验<0.05（特异性siRNA与阴性siRNA）。医生：用硼替佐米（10 nmol/L）处理稳定表达GFP-LC3B的DU145细胞24小时，然后用抗泛素抗体和Hoechst 33342进行免疫染色。然后对细胞进行共焦显微镜检查。一显示了GFP-LC3B点，而b条显示了泛素阳性的攻击性。中的合并图像c（c）表示GFP-LC3B puncta和aggresome的共定位。
图6
图6
抑制自噬增强蛋白酶体抑制剂诱导的癌细胞内质网应激。答：Bax阳性(a–c,e–g)和Bax缺乏(d日和小时)如24小时后的相差显微镜所示，在存在或不存在z-VAD（50μmol/L）的情况下，用MG132（1μmol/L）处理HCT 116细胞(a–d)和Hoechst染色(e–小时).箭头表示细胞凋亡(（f）)，在z-VAD的存在下大大降低了(克)或者在没有Bax的情况下(小时). 注意，细胞空泡化不受z-VAD或Bax的影响。B类：Bax缺陷的HCT 116或DU145细胞被转染siRNA，以对抗Atg公司用MG132（分别为0.25或0.5μmol/L）处理基因或阴性对照siRNA（Neg）48小时。24小时后量化空泡细胞的百分比。*和#P（P）< 0.01;$P（P）Z检验<0.05（每个细胞系中MG132加上特定siRNA与MG132再加上阴性siRNA。*和$HCT 116细胞；#DU145电池）。抄送：在存在（封闭柱）或不存在（开放柱）3-MA（10 mmol/L）的情况下，用乳酸菌素（5μmol/L）、ALLN（10μmol/L）或硼替佐米（20 nmol/L”）处理HCT 116 Bax阴性细胞24小时。测定有空泡的细胞百分比*P（P）Z检验<0.01（每个蛋白酶体抑制剂无3-MA组与含3-MA组）。医生：Bax缺陷HCT 116细胞用载体对照治疗(一)或MG132（1μmol/Lb条)持续24小时，然后用抗calnexin抗体进行免疫染色。电子邮箱：DU145型(一和b条)或Bax缺陷的HCT 116细胞(c（c）和d日)用MG132（分别为1或5μmol/L）处理24小时，然后进行电子显微镜分析。所示的代表性图像表明ER管腔的渐进性扩张。中的装箱区域一在中放大b条.箭头指示所选ER的扩张段(b条). 比例尺：0.25μm(一和b条)，2微米(c（c）和d日). N、 核心。传真：用MG132（1μmol/L）处理HCT 116细胞指定时间，然后进行免疫印迹分析。德国：Bax缺乏HCT 116(一和b条)和DU145(c（c）和d日)用siRNA转染细胞附件8/LC3B(b条和d日)或负siRNA(一和c（c）)36小时后，用MG132（分别为0.1或0.25μmol/L）处理16小时。典型的电子显微照片显示Atg8/LC3B敲低细胞中自噬受到抑制，内质网扩张增强(b条和d日). N、 细胞核；黑色箭头，自噬空泡；白色箭头，未稀释ER。比例尺=1μm。高：用所示的siRNA转染Bax缺陷的HCT 116细胞，并用MG132处理F类制备总细胞裂解物，并以Ac-LEVD-AFC为底物测定caspase-4活性。结果表示为与未治疗对照组相比增加的倍数。
图7
图7
IRE1与蛋白酶体抑制剂诱导的自噬密切相关。答：用指定浓度的硼替佐米或MG132或ER应激诱导剂A23187（A，2.5μmol/L）、thapsigargin（TG，0.5μmol/L）或tunicamycin（TM，5μg/ml）处理野生型和IRE1α/β缺陷型MEF 24小时。然后进行免疫印迹分析。B类和抄送：用载体对照、硼替佐米（10 nmol/L）、MG132（1μmol/L）或A23187（2.5μmol/L）处理表达GFP-LC3B的野生型和IRE1α/β缺陷型MEF 24小时。评估GFP-LC3B的穿孔(B类). 量化每个细胞的穿孔数（平均值±标准偏差）(C类). *P（P）通过单向方差分析（IRE1α/β缺陷型MEF与IRE1β阳性型MEF），差异<0.01。D类和电子邮箱：用针对IRE1α的特异性siRNA或阴性对照（Neg）siRNA转染HCT 116 Bax缺陷细胞24至48小时。用硼替佐米（10 nmol/L）或A23187（2.5μmol/L）治疗18至24小时。然后进行免疫印迹分析(D类). 或者，量化GFP-LC3B穿孔的程度(E类). *P（P）通过单向方差分析，<0.01（A23187和硼替佐米治疗组的siRNA-IRE1α与阴性siRNA相比）。
图8
图8
JNK而非XBP-1参与蛋白酶体抑制剂诱导的自噬。答：在指定浓度下用硼替佐米刺激野生型和IRE1α/β缺陷型MEF 24小时。收集细胞，并对总JNK和磷酸化JNK进行免疫印迹分析。B类和抄送：野生型(a–e)和XBP-1型-不足(f–j)用硼替佐米（20 nmol/L，b条,c（c）,克、和小时)或A23187（2.5μmol/L，d日,e（电子）,我、和j个)当面(c（c）,e（电子）,小时、和j个)或缺席(b条,d日,克、和我)JNK抑制剂SP600126（25μmol/L）16小时。评估GFP-LC3B的穿孔模式(B类)并量化(C类). * 和#P（P）通过单因素方差分析（硼替佐米或A23187治疗组的SP600125与溶媒对照组相比<0.01。*XBP-1+/+细胞；#XBP-1型−/−单元格）。医生：稳定表达GFP-LC3B的Bax缺陷HCT 116细胞用载体对照、硼替佐米（20 nmol/L）或A23187（2.5μmol/L）加或不加SP600126（25μmol/L）处理16小时。评估并量化GFP-LC3B的穿孔模式*P（P）通过单向方差分析，<0.01（硼替佐米或A23187治疗组的SP600125与媒介物对照）。电子邮箱：野生型和XBP-1型-用指定浓度的MG132或内质网应激诱导剂A23187（A，2.5μmol/L）、thapsigargin（TG，0.5μmol/L）或tunicamycin（TM，5μg/ml）处理缺陷MEF 24小时。然后进行免疫印迹分析。
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