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.2007年10月1日；110(7):2475-83.
doi:10.1182/bloud-2007-03-080077。 Epub 2007年7月5日。

α和β亚单位跨膜螺旋分离对信号传导中整合素外部的要求

朱洁清 1, 克里斯托弗·卡曼, 金民秀, 岛本茂, 蒂莫西·A·斯普林格, 冰昊罗
附属公司

α和β亚单位跨膜螺旋分离对信号传导中整合素外部的要求

朱洁清等人。 血液. .

摘要

通过整合素与细胞外配体的粘附调节细胞形状、迁移、生长和存活。整合素如何从外向内传递信号尚不清楚。而在静息整合素中，α和β亚单位跨膜结构域是相关的，配体结合促进这些结构域的分离和分离。在这里，我们讨论了外部输入信号是否需要这种分离。通过引入亚单位间二硫键，我们产生了突变整合素αIIbbeta3，其具有阻断的跨膜分离，结合配体，介导粘附，在配体结合后采用延伸构象，并在细胞表面形成类似于野生型的抗体诱导大簇。然而，突变整合素在细胞扩散、肌动蛋白应力纤维和局灶性粘附形成以及局灶性黏附激酶激活所测量的黏附诱导的外源性信号传导中表现出严重缺陷。这个缺陷通过二硫键的还原得以修复。我们的结果表明，跨膜结构域的分离是整合素外信号转导所必需的。

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图1
图1
αIIbβ3整合素在CHO-K1细胞上的表达及二硫键的形成（A）CHO-K1转染子的免疫荧光流式细胞术。用10E5（抗αIIb）、AP3（抗β3）和LM609（抗αVβ3复合物）对稳定转染野生型（WT）或半胱氨酸突变体（α968C/β693C）αIIbβ3整合素的CHO-K1细胞进行免疫染色，并用流式细胞术（-）检测。以小鼠转染的CHO-K1细胞作为对照。用X63对照IgG免疫染色的细胞如图所示（----）。（B） 免疫沉淀。用单克隆抗体10E5（抗αIIb）免疫沉淀来自（35）S标记CHO-K1稳定转染体的裂解物。WT或α968C/β693C突变体的沉淀物用非还原或还原负载缓冲液处理，并进行7.5%SDS-PAGE。显示了αIIb（α）、β3（β）和αIIb/β3（α/β）异二聚体的谱带。蛋白质分子大小标记的位置（单位：kDa）如左图所示。
图2
图2
配体结合和LIBS暴露（A）在1 mM Ca存在下CHO-K1稳定转染体的可溶性纤维蛋白原（Fg）或PAC-1结合2+/1 mM镁2+，1 mM锰2+，10μg/mL PT25–2加上1 mM Ca2+/1 mM镁2+，10μg/mL PT25–2加1 mM Mn2+，或1 mM DTT加上1 mM Ca2+/1 mM镁2+如图所示。通过流式细胞术测定结合活性，并按照“可溶性配体结合”所述进行表达。（B）CHO-K1转染体（用10μg/mL mAb LM609预孵育）在1 mM Ca存在下的粘附2+/1 mM镁2+或1 mM Ca2+/1 mM镁2+在涂有指定浓度纤维蛋白原的表面加上1 mM DTT。结合细胞的数量是通过测量乳酸脱氢酶（LDH）活性来确定的，如“细胞粘附”所述。数据是3个独立实验的代表性数据，每个实验一式三份。（C） LIBS风险。在存在或不存在50μM RGD肽（GRGDSP）或3 mg/mL人纤维蛋白原的情况下，用2种抗LIBS抗体D3和LIBS1对细胞进行染色2+/1 mM镁2+条件。LIBS表位表达表示为抗LIBS抗体的平均荧光强度相对于构象依赖性抗β3单克隆抗体AP3的百分比。误差线为标准偏差（SD）。
图3
图3
细胞扩散试验（A）CHO-K1稳定转染体在37°C下粘附于固定化人纤维蛋白原（存在10μg/mL mAb LM609）或配体-抗体PAC-1（存在或不存在1mM DTT）后的微分干涉对比度（DIC）图像。这些图像代表了三个独立实验中的一个。比例尺代表10μm。（B） 如“细胞扩散和显微镜”所述，定量粘附/扩散细胞的面积。误差条为SD。（C）DTT还原二硫键。允许（35）S标记的转染体在37°C下，在有或无1 mM DTT的情况下粘附在固定化纤维蛋白原上1小时，然后用10E5（抗αIIb）进行免疫沉淀，并在非还原条件下加载在7.5%SDS-PAGE上。显示了对应于αIIb（α）、β3（β）或αIIbβ3（α/β）异二聚体的带。蛋白质分子大小标记的位置（单位：kDa）如左图所示。
图4
图4
αIIbβ3整合素在局灶性粘附位点的募集允许细胞在37°C、1 mM DTT存在或不存在的条件下，在固定化纤维蛋白原（存在10μg/mL mAb LM609）上粘附1小时，然后按照“细胞扩散和显微镜”中的描述，用抗病毒蛋白和抗αIIb mAb PT25-2与Alexa Fluor 488偶联进行固定和染色对染色细胞进行共焦显微镜观察。比例尺代表10μm。
图5
图5
固定化纤维蛋白原稳定转染CHO-K1细胞中肌动蛋白应力纤维的形成细胞接种在纤维蛋白原涂层表面（存在10μg/mL mAb LM609），并在37°C下培养1小时，存在或不存在1mM DTT。在固定和通透性后，用Alexa Fluor 546结合的卵磷脂和Alexa Fluor 488结合的抗αIIb单克隆抗体PT25-2对粘附细胞进行染色。对染色的细胞进行共聚焦显微镜检查。比例尺代表10μm。
图6
图6
固定化配体上细胞粘附后的蛋白质酪氨酸磷酸化（A）在1 mM DTT存在或不存在的情况下，粘附固定化纤维蛋白原或BSA（在10μg/mL mAb LM609存在下）1小时后，稳定转染WT或突变体（α968C/β693C）αIIb/β3的CHO-K1细胞中的蛋白酪氨酸磷酸化。用抗磷脂酰肌动蛋白单克隆抗体4G10和PY20对总细胞裂解物进行印迹，并用抗β-肌动蛋白重新印迹（下面板）。箭头显示了3种蛋白的位置，这些蛋白在纤维蛋白原粘附后，磷酸酪氨酸信号显著增加。左侧显示了蛋白质分子大小标记（单位：kDa）的位置。（B） 转染CHO-K1细胞中黏着斑激酶（FAK）的酪氨酸磷酸化。细胞粘附在纤维蛋白原或BSA涂层培养皿上1小时，然后溶解。用抗FAK单克隆抗体免疫沉淀粘附细胞的裂解液，并用抗FAK（pY397）（兔抗血清）进行印迹（上面板）。然后用抗FAK兔多克隆IgG（下面板）剥离并重新缝合相同的膜。（C） FAK酪氨酸磷酸化的定量。如“免疫沉淀和蛋白质印迹”所述，定量印迹磷酸化-FAK（Tyr397）和总FAK的强度。FAK酪氨酸磷酸化程度表示为磷酸化-FAK（pY397）信号相对于总FAK信号的百分比。结果是3个独立实验的平均值。误差条为SD。
图7
图7
抗体诱导的整合素聚集及其对FAK激活的影响（A）抗体诱导的整合素聚集的共焦图像。将生长在Delta T培养皿上的稳定转染细胞用无功能抗-αIIbβ3单克隆抗体染色，然后在（i）或（ii）固定之前用山羊抗鼠IgG结合Alexa Fluor 488染色。比例尺代表10μm。（B） 将WT或α968C/β693C突变CHO-K1细胞转染剂悬浮液与（第2、3道）或不含（第1道）非抑制性抗αIIbβ3 mAb在37°C下在不存在（第2道）或存在（第3道）山羊抗小鼠IgG的情况下孵育1小时。作为对照，在1 mM Mn的存在下用类配体抗体PAC-1（第4道）培养细胞2+和10μg/mL活化抗体PT25-2，或在不存在（对于WT）或存在（对于α968C/β693C）1mM DTT的情况下粘附在Fg包被的培养皿上（泳道5）。从细胞裂解液中免疫沉淀FAK，并用抗磷酪氨酸单抗4G10（FAK-pY）印迹，然后用抗FAK（总FAK）重新印迹。
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