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.2007年7月2日；178(1):71-84.
doi:10.1083/jcb.200611064。

线粒体E3泛素连接酶MARCH5是依赖Drp1的线粒体分裂所必需的

马吕斯·卡博夫斯基 1, 阿尔伯特·诺兹纳, 理查德·尤尔
附属公司

线粒体E3泛素连接酶MARCH5是依赖Drp1的线粒体分裂所必需的

马吕斯·卡博夫斯基等。 J细胞生物学. .

摘要

我们确定线粒体E3泛素连接酶MARCH5是线粒体分裂的关键调节因子。MARCH5环突变体和MARCH5RNA干扰导致线粒体异常伸长和互连，表明线粒体分裂受到抑制。Drp1的异位表达逆转了MARCH5 RING突变表达细胞中异常的线粒体表型，但没有逆转另一个线粒体裂变蛋白Fis1。此外，正如Drp1的异常聚集和线粒体积累，以及YFP-Drp1在表达MARCH5 RING突变体的细胞中的细胞迁移率降低所表明的那样，MARCH6活性调节Drp1在亚细胞中的运输，可能是通过影响断裂部位的正确组装或裂变复合物的分解步骤。这种活性的丧失可能是观察到的线粒体分裂缺陷的原因。最后，MARCH5 RING突变体和内源性Drp1，而非野生型MARCH4或Fis1，以依赖于Drp1 GTPase的方式共同组装成异常增大的簇，表明这些蛋白质之间存在分子相互作用。总之，我们的数据表明线粒体分裂受MARCH5泛素依赖性开关调节的模型。

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数字

图1。
图1。
MARCH5环结构域突变导致线粒体形态异常。各种E3泛素连接酶的MARCH5结构和RINGv结构域的序列同源性。预测会影响MARCH5环指结构域活性的保守组氨酸43（红色）和半胱氨酸65和68（蓝色）发生突变，导致H43W和C65S、C68S突变体（A）。表达野生型MARCH5-YFP、（绿色；B）、MARCH5的HeLa细胞的线粒体形态H43瓦-YFP（绿色；C和D）和3月5日C65S、C68S-通过共焦显微镜分析YFP（green；E）。细胞色素染色显示线粒体（红色）c（c）记分具有控制型管状线粒体、异常连接的线粒体以及主要位于核周区域的线粒体的细胞数量（F）。数据表示每种条件下四次转染的平均±SD，每次计数100个细胞。
图2。
图2。
MARCH5 RNAi诱导的异常线粒体互连。（A） 通过Western blot分析转染GFP-和MARCH5-沉默载体9天后收获的GFP-RNAi或MARCH5-RNAi细胞的MARCH5。还测试了与线粒体动力学调控有关的Mfn2、Drp1和Fis1蛋白的表达水平。抗α-微管蛋白抗体用作负荷对照。通过共焦显微镜分析GFP RNAi和MARCH5 RNAi细胞中抗Tom20单克隆抗体显示的（B–D）线粒体形态。GFP RNAi和MARCH5 RNAi细胞（D）中具有控制样管状线粒体、异常连接和破碎线粒体的细胞数量。数据表示每种条件下三次转染的平均±SD，每次计数150个细胞。
图3。
图3。
表达MARCH5 RING突变体的细胞线粒体体积和连通性的量化。采用线粒体-PAGFP扩散法（A–C）和FRAP（D–F）研究野生型MARCH5和MARCH5RING突变表达细胞中线粒体网络单位的相对大小。对于基于mito-PAGFP的线粒体互联性分析，细胞被CFP-标记的WT MARCH5（A和C）、MARCH6共同转染H43瓦（B和C），3月5日C65S、C68S（C） 与mito-PAGFP联合或单独转染mito-PAGFP（C）。表达野生型MARCH5（A）和MARCH4的典型细胞的假彩色图像H43瓦（B） 如图所示。使用MetaMorph图像分析软件（C）量化线粒体互连程度。如图所示，红色条表示每个实验组17次测量的平均值±SD。黑钻石表示从每个单细胞测量中获得的值（C）。用CFP标记的WT MARCH5、MARCH4瞬时共转染HeLa细胞H43瓦，3月5日C65S、C68S-用FRAP测定YFP与mito-YFP或单独转染mito-YFP的线粒体体积。典型的对照组、表达有丝分裂YFP的细胞（D）和表达MARCH5的细胞H43瓦FRAP实验中使用的mito-YFP（E）显示在用红环指示的感兴趣区域的光漂白之前和之后。每组19个单细胞分析的平均值后获得的FRAP曲线，以及指示实验组中FRAP的程度如F所示。
图4。
图4。
MARCH5 RING突变体的软骨下聚结。表达野生型MARCH5-YFP、MARCH5的HeLa细胞h43瓦-YFP和3月5日C65S、C68S-对YFP进行Tom20免疫染色，并通过共聚焦显微镜进行分析。表达MARCH5的细胞示例H43瓦-用于分析的Tom20的YFP（绿色）和免疫染色（红色）如A所示。Tom20与MARCH5蛋白的共定位程度是使用图像分析软件Volocity（B）进行的。B中显示的值表示Pearson相关单位（r），它显示了共焦图像不同通道中像素的关联程度。（C） Myc-tagged野生型MARCH5和MARCH6的寡聚状态H43瓦用化学交联剂BMH或溶剂DMSO处理的细胞进行Western blot分析。对富含线粒体的重膜组分（HM）进行SDS-PAGE和Western blot分析。用抗Myc单克隆抗体检测到MARCH5。用抗Hsp60单克隆抗体控制负荷。星号代表非特定带。
图5。
图5。
Drp1与MARCH5环突变体的线粒体复合体共定位。转染MARCH5-YFP（A；绿色）、MARCH5的细胞H43瓦-YFP（B；绿色）和3月5日C65S、C68S-对YFP（C；绿色）进行Drp1（红色）免疫染色，并通过共焦显微镜进行分析。A–C中的插入物显示了各个细胞的放大片段（白色方块）。使用蔡司LSM510软件（A′-C′）测量位于相应图像中所示细胞区域的Drp1（红线）和MARCH5变体（绿线）的相对荧光强度。注意MARCH5 RING突变体表达细胞中MARCH4和Drp1线扫描高度重叠。利用Volocity软件（D）的共定位功能分析了Drp1与MARCH5不同变体共定位的总体程度。所示值代表皮尔逊相关单位（见正文）。用MARCH5-YFP（E和H）和MARCH5转染如前所述获得的Drp1 RNAi（E、F和H）细胞和对照RNAi细胞（G和H）（Lee等人，2004）H43瓦-YFP（F–H），对Tom20进行免疫染色，以显示OMM（叠加图像中的红色），并通过共焦显微镜进行分析。E和F中的底部面板显示放大的单元格碎片，用红色方块表示。箭头表示过氧化物酶体、箭头线粒体H43瓦用Tom20作为对照RNAi和Drp1 RNAi细胞进行定量（H）。关联度显示为皮尔逊相关单位（r）。
图6。
图6。
MARCH5 RING突变降低Drp1的细胞流动性。用YFP-Drp1瞬时转染HeLa细胞，无论是否与MARCH5-CFP、MARCH5共转染H43瓦-CFP和3月5日C65S、C68S-利用FRAP分析（A）分析CFP中Drp1的细胞迁移率。下图（A）显示了所示实验组在光漂白后1.73 s和19.66 s的平均回收曲线和FRAP值。Western blot（B）分析Drp1与线粒体的关联程度。全细胞裂解物（WCL）和富含线粒体的重膜（HM）组分是从转染Myc-tagged、野生型MARCH5和MARCH6的HeLa细胞中获得的H43瓦使用SDS-PAGE对蛋白质进行解析，然后对Drp1进行免疫染色。用抗Hsp60抗体控制负荷。从表达Myc-tagged、野生型MARCH5和MARCH4的细胞中获得的HM组分H43瓦也用化学交联剂BMH或溶剂DMSO处理。通过Western blot分析样品的Drp1（C）。
图7。
图7。
MARCH5 RING突变体的表达可恢复Mfn1KO和Mfn2KO细胞中的管状线粒体。（A） 野生型MARCH5和MARCH4内源性Mfn2的表达水平H43瓦-Western blot分析表达细胞。全细胞裂解物（WCL）和富含线粒体的重膜（HM）组分是从有无MG132培养的HeLa细胞中获得的，并转染Myc-tagged MARCH5和MARCH6H43瓦使用SDS-PAGE解析蛋白质，然后使用抗Mfn2多克隆抗体进行免疫染色。通过抗Hsp60抗体的免疫染色控制负荷。转染MARCH5-YFP（B；叠加图像上的黄色）或MARCH5的Mfn2KO细胞H43瓦-YFP（C和D；叠加图像上的绿色）用抗细胞色素染色c（c）单克隆抗体显示线粒体（叠加图像上为红色），并通过共焦显微镜进行分析。在E中，对细胞线粒体的形态进行评分。数据表示三次转染的平均值±SD，每次计数100个细胞。
图8。
图8。
MARCH5的影响H43瓦对Mfn2KO细胞中线粒体融合率的影响。Mfn2KO MEFs（A和D）、Mfn2-KO MEF体外表达Mfn2（B和D）或MARCH5的线粒体融合H43瓦-CFP（C和D）采用基于mito-PAGFP稀释法进行分析。包含光激活的mito-PAGFP（红色方块）的细胞区域的详细信息显示在相应图像下方。用较高的探测器增益获得了光激活前的细胞图像。在实验期间，对mito-PAGFP的稀释率进行了量化（D）。数据被归一化，光活化后30秒的mito-PAGFP荧光为100%。数据表示62（Mfn2KO细胞）和53（Mfn 2KO表达MARCH5的细胞）的平均值±SDH43瓦)和32个（Mfn2KO细胞体外表达Mfn2）ROI测量值（D）。
图9。
图9。
Drp1异位表达逆转MARCH5突变诱导的线粒体形态缺陷。用MARCH5-YFP、MARCH5瞬时转染HeLa细胞H43瓦-YFP（A；绿色）和3月5日C65S、C68S-YFP（B；绿色）与Drp1共转染，然后用抗Tom20多克隆抗体（A和B；蓝色）和抗Drp1单克隆抗体（B和A；红色）进行免疫染色。星号代表现场转染的细胞。细胞线粒体形态评分。数据表示四次转染的平均±SD，每次计数100个细胞（C）。
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