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.2007年6月29日；129(7):1351-63.
doi:10.1016/j.cell.2007.04.035。

HEF1依赖的极光A激活诱导初级纤毛的分解

埃琳娜·普加切娃 1, 桑德拉·亚布隆斯基, 蒂芬尼·R·哈特曼, 伊丽莎白·P·亨斯克, 艾丽卡·A·戈勒米斯
附属公司

HEF1依赖的极光A激活诱导初级纤毛的分解

埃琳娜·普加切娃等。 单元格. .

摘要

哺乳动物纤毛从极化细胞的顶端/管腔表面伸出，充当环境信号的传感器。许多发育障碍和病理状况已被证明是由纤毛相关信号蛋白的缺陷引起的。尽管越来越多的证据表明纤毛是细胞信号协调的关键部位，但对控制纤毛形成和分解的细胞机制知之甚少。在这里，我们表明，纤毛基底体的促转移支架蛋白HEF1/Cas-L/NEDD9和致癌Aurora A（AurA）激酶之间的相互作用导致HDAC6的磷酸化和活化，HDAC6是一种微管蛋白脱乙酰化酶，促进纤毛解体。我们表明，这一途径对于睫状体吸收是必要的，也是充分的，并且它在脊椎动物中构成了AurA的一种意料之外的非有丝分裂活动。此外，我们证明AurA和HDAC6小分子抑制剂从调节的再吸收线索中选择性稳定纤毛，这表明这些临床药物的一种新的作用模式。

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图1
图1。睫状体解体时基底体AurA激活
A类.纤毛的组装。在两个独立的实验中平均计算了200个细胞B类.血清刺激诱导纤毛解体。在4个实验中，每个实验平均计数150个细胞。C类具有AurA抗体（绿色）、乙酰化α-微管蛋白抗体（蓝色）和DNA抗体（红色）的静止细胞的免疫荧光。比例尺10μm。在本面板和随后的面板中，主图像中的方框表示右侧高倍显示的结构。D类.带有HEF1多克隆兔抗体的静止细胞的免疫荧光（绿色），也可见乙酰化α-微管蛋白（蓝色）和DNA（红色）；也可以与E类.比例尺10μm。E类用HEF1单克隆抗体（绿色）对静止细胞进行免疫荧光，也可显示γ-微管蛋白（蓝色）和DNA（红色）。比例尺5μm。另请参见补充图S3A。F类.静态细胞的免疫荧光，带有对磷酸化阿魏酸（绿色）、乙酰化α-微管蛋白（蓝色）和DNA（红色）的抗体。比例尺12.5μm。G公司.血清刺激细胞的免疫荧光，其抗体为磷酸-尿酸（绿色）、乙酰化α-微管蛋白（蓝色）和DNA（红色）。比例尺5μm。H（H）血清刺激后hTERT-RPE1细胞AurA和HEF1的西方分析。所示的蛋白质印迹代表单个凝胶的条带和复制品。较高分子量的HEF1带反映了过度磷酸化，与血清添加后2小时和24小时AurA激活和睫状体解体相一致（时间点0）。浅灰色箭头表示磷酸化-AurA定向抗体与总AurA的交叉反应性；黑色箭头表示磷化-AurA。另请参见补充图1H。我。免疫荧光显示纤毛解体期间血清刺激细胞中AurA的激活。所有图像都是乙酰化α-微管蛋白（红色）、磷酸化-AurA或总AurA（绿色）和DNA（蓝色）的合并面板。
图2
图2。AurA的激活对睫状体吸收是必要的
A类在血清添加后0至24小时内，将用siRNA处理的细胞中的纤毛分解为AurA或HEF1，或用Scrambled（Scr）对照siRNA。检测进行了3次，通过乙酰化微管蛋白染色平均计数/实验100个细胞。使用第二抗体（抗谷氨酰化微管蛋白）在纤毛耗竭后独立评分，结果得到证实（补充图S4D、S4E）。B类用对照（Scr）、AurA-靶向（siA）或HEF1-靶向（siH）siRNA预处理的纤毛细胞通过补充血清培养基诱导纤毛解体。在添加血清后2、12和24小时，AurA被免疫沉淀，并用于体外激酶检测，如所示（Pugacheva和Golemis，2005）。展示，32反应中P标记的磷酸化组蛋白H3（顶部）和总组蛋白H3.（考马斯蓝染色，底部）。C类在指定的时间点，未经处理的hTERT-RPE1细胞（--）或用靶向siRNA的对照（Scr）或HEF1处理的hERT-RPE1细胞中的纤毛长度。D类用AurA抑制剂（PHA-680632）或二甲基亚砜处理纤毛化hTERT-RPE1细胞，然后在添加血清后24小时追踪纤毛的分解。这个在体外对于AurA，PHA-680632的IC50为27 nM；该化合物对AurC、AurB和FGFR1的抑制作用也较小（IC50分别为120、185和390 nM，Soncini等人，2006）。如补充图S4D所示，使用抗谷氨酰化微管蛋白确认结果。E类分析与中描述的实验并行进行D类证明PHA-680632阻止T的外观288-磷酸化-AurA（用BioLegend的抗体可视化）和HEF1磷酸化（115kDa形式），参考2小时和24小时的DMSO（-）。黑色箭头标记磷酸化AurA和超磷酸化（p115）HEF1；灰色箭头表示p105 HEF1。另请参见图S1I。F类用指示浓度的AurA抑制剂PHA-680632处理细胞，然后进行AurA免疫沉淀，并用于体外激酶反应（左）或用于Western分析的全细胞裂解物，以及对总AurA或磷酸化AurA的抗体（右）。G公司。在DMSO或PHA-680632处理的细胞中，在血清刺激后的时间，对磷酸化-AurA的出现进行免疫荧光分析。DNA（蓝色）、乙酰化α-微管蛋白（红色）和T288-磷酸-AurA（绿色）。在18小时的DMSO/ph-AurA中，一个星号（*）表示在纤毛缩短处罕见地观察到磷酸化-AurA。H（H）在血清刺激后所指示的时间用DMSO载体或PHA-680632处理的细胞的FACS分析。
图3
图3。微量注射活性AurA导致纤毛快速脱落
A类将野生型AurA、T288A或D274N突变AurA或GST或PBS缓冲液微量注射到具有预先形成的纤毛的hTERT-RPE1细胞中。（-），未注射控件。时间反映了从注射到开始固定载玻片的分钟数。实验重复3次，每次实验得分>100个注射细胞。B类.Cilia注射AurA或D274N后45分钟。红色乙酰化α-微管蛋白；蓝色，谷氨酰化的α-微管蛋白（纤毛的第二个独立标志物）；蓝色，DNA；绿色，右旋糖酐488表示注入细胞。右侧的高倍图像来自装箱的单元格；*标记未注射细胞的放大倍数。C类AurA和突变体（D274N，T288A）与组蛋白H3（17 kD）和MBP（22 kD）底物在在体外激酶分析，确认激酶活性+裂解液表明突变体在4°C下与hTERT-RPE1细胞裂解液孵育3小时，然后取下并用于激酶分析。
图4
图4。HDAC6活性对纤毛的吸收是必要的
A类用组蛋白去乙酰化酶抑制剂治疗hTERT-RPE1细胞可防止睫状体再吸收。在诱导睫状体解体之前，用所示化合物或载体（DMSO）以方法中所述的浓度培养细胞2小时。该分析进行了3次，每个时间点平均计数100个细胞。B类TSA和tubacin增加细胞内乙酰化微管蛋白的水平。如图所示，免疫印迹显示经TSA、管沙星、尼罗管沙星或载体（DMSO）处理的细胞中乙酰化微管蛋白水平C类GSK3β抑制剂和法尼基转移酶抑制剂（FTI）不抑制睫状体解体。D类HDAC6耗竭限制了血清诱导的hTERT-RPE1细胞纤毛解体，该细胞转染siRNAs至HDAC6、HDAC2或加扰对照细胞48小时。E类用siRNA处理的hTERT-RPE1细胞到HDAC6、HDAC2或加扰对照的西方分析。F类将活性AurA或PBS微量注射到用tubacin或DMSO预处理2小时的hTERT-RPE1细胞中。
图5
图5。AurA直接磷酸化激活HDAC6微管蛋白脱乙酰酶活性
A类用AurA抑制剂PHA 680632（+）或载体（-）处理的细胞的hTERT-RPE1全细胞裂解物（WCL）直接通过Western blot进行分析，或在免疫沉淀（IP）后使用指示的抗体进行AurA抗体分析。慢粒型HDAC6的免疫沉淀不受PHA-680632细胞治疗的影响，这表明它很可能代表由额外（未知）细胞激酶修饰的HDAC6。B类AurA磷酸化HDAC6。将体外翻译和免疫沉淀的HDAC2或HDAC6（HD2，HD6）或重组GST（-）与重组AurA混合并用于体外激酶分析。反应被分割并用于放射自显影(32P） 或Western Blot（WB）C类体外翻译的HDAC2或HDAC6（HD2，HD6）被免疫沉淀（IPed）。IP与AurA（+）或缓冲区（-）混合，然后用于在体外微管蛋白脱乙酰化试验，或在体外γ激酶测定-32P-ATP（见方法）。如图所示，通过Western blot和放射自显影术观察反应混合物。D类HDAC6定位于血清治疗2小时后纤毛的分解。比例尺，15μM。
图6
图6。IFT蛋白在AurA诱导的睫状体再生中的作用
A类Western blot显示血清治疗后纤毛化hTERT-RPE1细胞中IFT88（siIFT88）的siRNA缺失，与干扰完全对照组相比。B类。免疫荧光与图6A在时间0时相匹配，表明基底体IFT88的相对耗竭程度。C类血清治疗后0、12或18小时，IFT88缺失细胞（s88）与Scr缺失细胞的纤毛解体，基于总细胞数（灰条）。黑条（右）表示时间0时纤毛细胞百分比，该百分比是根据免疫荧光确认的具有显著IFT88染色（88+）或IFT88完善（88-）的细胞计算得出的。D类用干扰（Scr）或AurA-靶向（siAurA）siRNAs或PHA-680632处理的细胞在血清启动的拆卸后2小时固定。如图所示，免疫荧光显示纤毛（抗乙酰化α-微管蛋白，红色）和IFT88（绿色）。插图是框状睫状结构的放大；箭头表示睫状体相对于基底体的投影方向。比例尺，10μm。
图7
图7。工作模式
A类Aurora A（AurA）和低水平HEF1定位于静止纤毛细胞的基底体。B类我们的数据与生长因子诱导HEF1表达，促进HEF1依赖的Aurora a激活的模型一致。这导致Aurora a对睫状体HDAC6 6（H6）进行磷酸化，从而诱导睫状体再吸收。
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    1. Benzing T、Gerke P、Hopker K、Hildebrandt F、Kim E、Walz G.肾胱氨酸与Pyk2、p130（Cas）和张力蛋白相互作用并触发Pyk1的磷酸化。美国国家科学院院刊2001；98:9784–9789.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Benzing T，Walz G.Cilium生成的信令：蜂窝GPS？肾性高血压。2006;15:245–249.-公共医学
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