跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2007年6月；4（6）：e186。
doi:10.1371/journal.pmed.0040186。

血管内皮生长因子通过内部表达的VEGFR1/FLT1介导人乳腺癌细胞的细胞内存活

李泰熙 1, 赛哈·森, Sekine Masayuki Sekine Sekine Sekine Sekine Sekine Sekine Sekine Sekine Sekine Sekine Sekine Sekine Sekine Sekine Sekine Sekine Sekine Sekine Sekine Sekine, 西莫娜·辛顿, 易工服, 哈瓦·卡森蒂·阿夫拉罕, 沙洛姆·阿夫拉罕
附属公司

血管内皮生长因子通过内部表达的VEGFR1/FLT1介导人乳腺癌细胞的细胞内存活

李泰熙等。 公共科学图书馆医学. 2007年6月.

摘要

背景：虽然乳腺肿瘤中血管内皮生长因子（VEGF）的表达与乳腺癌发病机制中的不良预后相关，但VEGF受体VEGFR1（也称为FLT1）和VEGFR2（也称为KDR或FLK1）以及神经纤维蛋白1（NRP1）的表示、定位和功能，在乳腺癌中是有争议的。

方法和结果：我们研究了VEGF和VEGF受体在乳腺癌细胞中的表达和功能。我们观察到VEGFR1表达丰富，VEGFR2表达低，NRP1表达可变。与对照细胞相比，转染反义VEGF cDNA或siVEGF（VEGF靶向小干扰RNA）的MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞VEGF表达显著降低，凋亡增加。此外，siRNA特异性靶向敲除VEGFR1表达（siVEGFR1）通过下调蛋白激酶B（AKT）磷酸化显著降低乳腺癌细胞的生存率，而靶向敲减VEGFR2或NRP1表达对这些癌细胞的存活率没有影响。由于VEGFR1特异性配体胎盘生长因子（PGF）并不像预期的那样抑制siVEGF诱导的乳腺癌细胞凋亡，而且VEGFR1-抗体也对这些细胞的存活率没有影响，因此我们检测了VEGFR2的定位。VEGFR1主要在MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞内表达。具体而言，VEGFR1被发现与层粘连蛋白A/C共定位，并且主要在乳腺癌细胞系和原发性乳腺癌肿瘤的核膜中表达。用siVEGFR1处理的乳腺癌细胞显示出VEGFR1表达水平显著降低，并且核膜中缺乏VEGFR1表达。

结论：据我们所知，这项研究首次证明了乳腺癌细胞中存在一种独特的生存系统，VEGF通过与VEGFR1的结合，可以作为一种内部自分泌（脑内）生存因子。这些结果可能导致基于抑制血管生成的肿瘤治疗策略的改进。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。VEGF受体在乳腺癌细胞中的表达及VEGF下调对MDA-MB-231细胞凋亡的影响
（A） 用免疫沉淀（IP）和Western blot（WB）分析方法检测几种乳腺癌细胞系中VEGF受体的表达。（B） 共聚焦显微镜分析MDA-MB-231细胞中VEGFR2的表达。细胞用抗VEGFR2抗体或IgG（插图）染色。星号表示用编码可溶性人类VEGFR2的腺病毒转导的细胞，作为阳性对照。（C） 用反义VEGF载体转染MDA-MB-231细胞，并在Zeocin（1 mg/ml）存在下进行筛选。使用多克隆抗VEGF抗体，通过Western blotting（WB）评估MDA-MB-231转染体（pZeoSV、AS-C1和AS-C2）中VEGF的表达。用抗Csk抗体作为内部对照，通过Western blotting分析总蛋白提取物。用反义VEGF载体稳定转染（D和E）MDA-MB-231细胞，并用细胞周期分析（D）和TUNEL分析（E）测定这些细胞的存活率。（F） 用siCTL或siVEGF寡核苷酸瞬时转染MDA-MB-231细胞，并使用制造商指导的ELISA试剂盒对上清液中的VEGF进行定量（左图）。用细胞周期分析法检测这些细胞的凋亡情况。这些数据代表了三项独立研究（右图）。
图2
图2。VEGF诱导MDA-MB-231细胞中VEGF受体的表达
（A） 用VEGF（30 ng/ml）处理MDA-MB-231细胞和HBMEC，以检查其对VEGFR2磷酸化（顶部印迹）和表达（底部印迹）的影响。制备总细胞裂解物，然后使用4G10或抗VEGFR2抗体进行免疫沉淀（IP）和免疫印迹（WB）。箭头表示非特异性蛋白质带。（B） 使用抗VEGFR1或抗VEGFR2抗体对MDA-MB-231细胞的裂解物（5 mg）进行免疫沉淀。免疫复合物用抗VEGFR2抗体进行免疫印迹分析。剥离后，使用抗VEGFR1抗体对膜进行蛋白质印迹。（C） 如图所示，对来自不同转染MDA-MB-231细胞的裂解物（2 mg）进行免疫沉淀（IP）和Western blot（WB）分析，以检测VEGF和NRP1受体的表达。来自HBMEC的总蛋白裂解物（0.4 mg）用作阳性对照。（D） 对来自不同转染MDA-MB-231细胞的总RNA（5μg）进行RT-PCR分析血管内皮生长因子受体1或血管内皮生长因子2mRNA表达。GAPDH公司mRNA显示为内部控制。
图3
图3。siVEGFR2或siNRP1寡核苷酸对MDA-MB-231细胞存活的影响
（A） 本研究中使用的siRNA寡核苷酸（及其序列）购自Dharmacon。（B） 用编码野生型（w）或突变型（m）siVEGFR2或siLuc的逆转录病毒感染MDA-MB-231细胞，然后用嘌呤霉素（5μg/ml）筛选。对总RNA（5μg）进行RT-PCR分析血管内皮生长因子2mRNA表达。GAPDH公司mRNA显示为内部控制。（C） 如图所示，对从嘌呤霉素选择的细胞中提取的总蛋白提取物（5 mg）进行免疫沉淀（IP）和Western blot（WB）分析，以检测VEGF和NRP1受体的表达。（D） 用siCTL或siNRP1寡核苷酸瞬时转染MDA-MB-231细胞。培养5天后，制备总细胞裂解物，并使用抗NRP1抗体（左侧印迹）进行蛋白质印迹（WB）。使用抗Csk抗体作为内部对照，通过蛋白质印迹分析总蛋白提取物。通过细胞周期分析测定siNRP1处理细胞的存活率。这些数据代表了三项独立研究（右图）。
图4
图4。VEGFR1 siRNA寡核苷酸对MDA-MB-231细胞存活的影响
（A） siVEGFR1寡核苷酸对MDA-MB-231细胞凋亡的影响。用siLuc或各种siVEGFR1寡核苷酸（#1至#4）瞬时转染MDA-MB-231细胞。孵育5天后，裂解细胞并使用抗VEGFR1抗体进行蛋白质印迹（WB）。用抗Csk抗体作为内部对照，通过Western blotting分析总蛋白提取物。如图所示，用细胞周期分析法分析siVEGFR1处理的细胞的凋亡。（B） 用野生型（w）或突变型（m）siVEGFR1寡核苷酸瞬时转染MDA-MB-231细胞5 d。对总RNA（5μg）进行RT-PCR分析血管内皮生长因子受体1和血管内皮生长因子2mRNA表达；GAPDH公司mRNA显示为内部对照（顶部凝胶）。使用细胞周期分析（下图）测量siVEGFR1处理细胞的存活率。这些数据代表了四项独立研究。（C） MDA-MB-231细胞（5×106)经siVEGFR1或siCTL转染后，皮下注射到裸鼠的侧面。在第0天、第5天和第10天（分别为D-0、D-5、D10）测量肿瘤，并以厘米为单位表示三。每组小鼠的数量由n个-值*第页< 0.05. （D） 用siLuc或野生型（w）或突变型（m）siVEGFR1寡核苷酸瞬时转染MDA-MB-231细胞。培养5天后，制备总细胞裂解物，并使用磷酸化AKT（p-AKT）或VEGFR1抗体进行蛋白质印迹（WB）。使用抗Csk抗体作为装载的内部控制，通过Western blotting分析总蛋白提取物。
图5
图5。血管内皮生长因子及其受体siRNA寡核苷酸对MCF-7细胞存活的影响
（A） MCF-7细胞瞬时转染各种血管内皮生长因子或血管内皮生长因子受体siRNA寡核苷酸，如图所示。根据制造商的方案，使用DharmaFECT-1试剂进行转染程序。培养5天后，用抗VEGFR1或抗NRP1抗体对细胞进行裂解并进行Western blotting（WB）。使用抗Csk抗体作为内部对照，通过蛋白质印迹分析总蛋白提取物。或者，转染5天后，分离总RNA（5μg）并进行RT-PCR分析血管内皮生长因子和血管内皮生长因子2mRNA表达。GAPDH公司mRNA显示为内部控制。（B） 用siLuc、siNRP1、siVEGF或各种VEGF受体如图所示，在不存在或存在PGF（20 ng/ml）或VEGF（20 ng/ml）的情况下，使用siRNA寡核苷酸。培养5天后，收集细胞并进行细胞周期分析。这些数据代表了三项单独的研究。m、 突变体；w、 野生型。（C） 用siLuc、siNRP1、siVEGF或各种血管内皮生长因子受体siRNA寡核苷酸如图所示。培养5天后，在光学显微镜下观察细胞。（D） VEGF对MDA-MB-231细胞周期的影响。在有或无VEGF（20 ng/ml）的情况下，用siLuc或siVEGF寡核苷酸瞬时转染MDA-MB-231细胞。培养5天后，收集细胞并进行细胞周期分析。这些数据代表了三项单独的研究。
图6
图6。VEGFR1在乳腺癌细胞中的内部表达
（A） 在渗透和非渗透条件下，使用流式细胞术分析MDA-MB-231和MCF-7细胞中VEGFR1的表达。VEGFR1表达（灰色示踪）主要在渗透条件下内部检测到。黑色示踪显示有对照抗体染色。（B） 使用抗VEGFR1、抗层粘连蛋白B1、抗GAPDH和抗肌动蛋白抗体对从MDA-MB-231细胞和HUVEC中提取的细胞质和细胞核部分进行Western blotting（WB）。图中显示了MDA-MB-231细胞和HUVEC的细胞质（CE）和细胞核（NE）提取物中VEGFR1的相对表达水平*第页< 0.05.
图7
图7。VEGFR1在MCF-7和MDA-MB-231细胞中的定位
用抗VEGFR1和抗LMNA（Lamin A/C；核膜标记物）抗体对细胞进行染色。然后使用共焦显微镜检查VEGFR1的定位。LMNA特地定位于核膜。在MCF-7和MDA-MB-231细胞的核膜中观察到强烈的VEGFR1蛋白表达。合并染色显示VEGFR1和LMNA在核膜处共定位。
图8
图8。siVEGFR1处理后MDA-MB-231细胞中VEGFR2的定位
将siCTL、突变siVEGFR1（siVEGFR1m）或野生型siVEGFR1（siVEGFR1w）转染MDA-MB-231细胞，然后用抗VEGFR1和抗LMNA（Lamin A/C）抗体染色。在对照siCTL和siVEGFR1m转染细胞中，观察到VEGFR1蛋白的核膜强染色和核质弱染色，而在siVEGFR1w转染的细胞中，VEGFR1蛋白的表达显著降低，并且在核膜中未观察到VEGFR1的表达。合并染色表明VEGFR1和LMNA共定位。
图9
图9。VEGFR1蛋白在人乳腺组织中的定位
用抗VEGFR1和抗LMNA（Lamin A/C）抗体对人类乳腺肿瘤和正常乳腺的组织切片进行染色，以确定其定位。（A和B）VEGFR1在人类乳腺肿瘤的核膜和细胞质中与核膜标记物LMNA强烈共定位。（C和D）VEGFR1与LMNA在正常乳腺核膜处共定位。
图10
图10。VEGFR1抗体对细胞生长的影响
MDA-MB-231和MCF-7细胞在六孔板上亚融合生长，并用不同浓度的VEGFR1单克隆抗体处理。培养4天后，收集细胞并在血细胞仪上计数。数据以三项单独研究的平均值±SD表示。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Hicklin DJ，Ellis LM。血管内皮生长因子途径在肿瘤生长和血管生成中的作用。临床肿瘤学杂志。2004年；23:1011–1027.-公共医学
    1. Cai J，Ahmad S，Jiang WG，Huang J，Kontos CD，等。血管内皮生长因子受体-1的激活通过内皮细胞中的磷脂酰肌醇3-激酶途径维持血管生成和Bcl-2表达。糖尿病。2003;52:2959–2968.-公共医学
    1. Senger DR、Perruzzi CA、Feder J、Dvorak HF。一种由多种人类和啮齿动物肿瘤细胞系分泌的高度保守的血管通透性因子。1986年癌症研究；46:5629–5632.-公共医学
    1. Berkman RA、Merrill MJ、Reinhold WC、Monacci WT、Saxena A等。血管通透性因子/血管内皮生长因子基因在中枢神经系统肿瘤中的表达。临床投资杂志。1993;91:153–159.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Boocock CA、Charnock-Jones DS、Sharkey AM、McLaren J、Barker PJ等。卵巢癌中血管内皮生长因子及其受体flt和KDR的表达。国家癌症研究所杂志，1995年；87:506–516.-公共医学

出版物类型

MeSH术语